目前，癌症已经成为人类健康的重要威胁，结肠癌发病率和死亡率呈逐年上升趋势。结直肠癌的具体发病机制尚不明确，而且临床上针对中晚期的结直肠癌尚缺乏有效的治疗措施。一般认为溃疡性结直肠炎相关的结直肠癌经历“炎症-不典型增生-癌”的演变过程。炎性肠炎和克罗恩病是增加结直肠癌发生的两个重要危险因素。研究报道溃疡性结直肠炎能增加患结直肠癌的风险^[1]。化学预防是防治癌症的重要措施，是高风险癌症发病人群预防癌症的策略之一^[2]。

苦参为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait. 的干燥根，有清热燥湿、杀虫、利尿的功效^{[3, 4]}。苦参常用来治疗下焦湿热，临床上有关苦参的复方也用来治疗溃疡性结直肠炎，如肠愈宁胶囊^{[5, 6]}、复方苦参汤^{[7, 8]}等。苦参中的重要有效成分苦参碱与氧化苦参碱具有抗炎、抗肝纤维化、抗肿瘤等作用^{[9, 10]}，研究表明苦参碱与氧化苦参碱均能通过减少炎症因子的分泌，对溃疡性结直肠炎起到治疗或减缓作用^{[11, 12, 13]}，并可以诱导结直肠癌细胞凋亡^[14]。本研究在前期研究的基础上，采用氧化偶氮甲烷（AOM）联合葡聚糖硫酸钠（DSS）建立溃疡性结直肠炎诱发的结直肠癌模型，研究苦参碱与氧化苦参碱对炎症相关结直肠癌的化学预防作用。

苦参碱（HPLC测得质量分数≥98%，批号140805）与氧化苦参碱（HPLC测得质量分数≥98%，批号140801）均购自四川维克奇生物科技有限公司。AOM、甘氨酸、十二烷基硫酸钠购自美国Sigma-Aldrich公司；DSS（相对分子质量36 000～50 000）购自美国MP公司；增殖细胞核抗原（PCNA）鼠抗53兔抗、环氧合酶-2（COX-2）兔抗和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）兔抗购自英国Abcam公司；核转录因子-κB（NF-κB）兔抗购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin鼠抗购自中杉金桥公司；山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG购自美国Jackson公司，脱脂奶粉购自内蒙古伊利公司，PVDF膜购自美国Thermo公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自Millipore公司；过硫酸铵、N,N,N,N-四甲基乙二胺、聚山梨酯-20、溴酚蓝二硫苏糖醇购自美国Amersco公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京康维试剂公司；蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche公司；10%中性福尔马林固定液购自北京益利精细化学品有限公司；ECL发光液购自美国Millipore公司。

SPF级雄性Balb/c小鼠购自斯倍福（北京）实验动物科技有限公司，动物合格证号SCXK（京）2011-0004，6周龄，体质量18～22 g，饲养于北京中医药大学动物实验中心，饲养室保持良好通风，饲养环境温度为（25±2）℃，湿度（50±10）%，12 h循环光照。高脂饲料饲养，自由饮水。正常饲养1周以适应环境，第2周开始进行实验。

将40只雄性Balb/c小鼠随机分成4组，每组10只，分别为对照组、模型组、苦参碱（30 mg/kg^{[11, 15, 16]}）组和氧化苦参碱（30 mg/kg^{[11, 15, 16]}）组。除对照组外，其余各组小鼠单剂量ip 10 mg/kg的AOM生理盐水溶液，同时给予2% DSS水溶液自由饮用1周，造模第2周正常饮水，第3周给予2% DSS饮水，以此循环3次，之后给予正常饮水，直至第12周实验结束。苦参碱组和氧化苦参碱组从造模第2周开始每天ig给予苦参碱和氧化苦参碱水溶液1次，连续给药11周，模型组和对照组ig等量的水直至实验结束。造模时对照组ip等量的生理盐水，正常饮水，直至实验结束。

在实验过程中观察记录实验动物的活动状况、进食量、毛发状况、食欲、大便性状等，每周称量并记录体质量。至第12周实验结束，禁食24 h，脱颈椎处死，剪开小鼠腹腔，自盲肠末端将直肠与小肠分离，直至肛门处，取下整段结直肠，并沿肠管纵轴剖开，用预冷的PBS溶液清洗肠内容物。将冲洗干净的肠管黏膜面朝上，拍照测量。用洁净滤纸吸干残留的水液，从结直肠的肿瘤发生部位取2段长50～70 mm的肠段，一段置于10%中性福尔马林溶液中用于HE染色及免疫组化分析，另一段置于液氮中保存，用于Western blotting分析。

将结直肠组织从10%中性福尔马林溶液中取出，常规脱水，石蜡包埋，切片，进行HE染色、脱水、二甲苯透明。最后以中性树胶封片，光学显微镜下观察组织并拍摄。由2名经验丰富的病理医师阅片，按照WHO新分类确定各组动物结肠肿瘤发生的程度。

将各组组织切片梯度脱蜡水化，抗原热修复，放入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中，加热5～10 min后冷却至室温，PCNA按照1:5 000稀释后加入，4 ℃过夜。后用0.01 mol/L的PBS洗2 min，共洗3次。DBA显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，观察。每张切片在高倍镜（20×10）下随机选取5个视野，采用数码相机，Olympus X 71多功能显微镜及图像分析软件（Image Pro Plus 6.0）进行数据采集及分析，比较各阳性染色部位的平均吸光度值。

从液氮中取出结直肠肿瘤组织研碎，称取10 mg左右，提取总蛋白，按BCA试剂盒的说明书测总蛋白的量，并用RIPA调整蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳、转膜，滴加一抗、二抗进行免疫反应，化学发光、显影、定影，最后将胶片进行拍照，用Image-J软件测定各条带灰度值，以β-actin作为内参照，以iNOS、COX-2、P53、NF-κB、γH2AX与β-actin蛋白条带灰度值之比作为其相对表达的值。

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，计量资料表示为x±s，各组数据采用单因素方差分析。用Graph Pad Prism 6.0作统计图。

模型组在给予2% DSS饮水后小鼠活动减少，进食量减少，精神萎靡不振，逐渐出现大便稀溏，后逐渐发展为便血，换正常饮水后症状逐渐缓解，在实验第6～12周再次出现便血现象，并有动物出现脱肛现象，有3只动物因便血过重而死亡。给予苦参碱和氧化苦参碱后能显著改善动物的活动状况，但也有3只动物在实验过程中因便血过重而死亡。

实验结束取材时发现模型组动物结直肠肠壁增厚、皱缩，结直肠水肿、缩短、增重。结直肠肿瘤的发生部位集中在结肠远端，主要在距离肛门4～6 cm的部位，呈弥散状铺开。对照组小鼠结直肠呈淡红色，光滑，厚薄均匀。由于结直肠发生肿瘤部位出现水肿，肿瘤弥散状，不宜统计其肿瘤个数及体积，因此采用Image-J统计肿瘤区域面积，通过比较结直肠的长度、结直肠的质量、最大肿瘤体积及肿瘤区域的面积所占比例宏观分析肿瘤的发生程度。如表 1所示，给予苦参碱和氧化苦参碱后，能够明显降低结直肠的质量，抑制结直肠的缩短，减小肿瘤体积，减少肿瘤区域。

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠结直肠大体形态学指标 Table 1 General morphological data of mouse colorectum in each group (x±s, n = 7) 组别 结直肠质量/g 结直肠最大肿瘤体积/mm3 结直肠长度/mm 结直肠肿瘤区域面积比值/% 对照 0.30±0.06 0.000± 0.000 118.05± 6.57 0.00± 0.00 模型 0.96±0.35 85.598±71.967 83.26±12.40 63.89± 7.68 苦参碱 0.58±0.13 43.411±23.820*# 85.51±24.39 36.42±12.97*# 氧化苦参碱 0.45±0.14 22.183±25.873*# 104.94±10.33*# 23.38±13.75*# 与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05 *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group

表 1 各组小鼠结直肠大体形态学指标 Table 1 General morphological data of mouse colorectum in each group

根据WHO消化系统肿瘤分级评判标准，模型组和给药组的肿瘤全部在腺瘤阶段，未发展成为浸润性腺癌^[17]，如图 1所示。在模型组可以明显看到腺体增生，大小和形状十分不规则，细胞体积增大，细胞核分裂增多，可见腺管共壁和筛样结构，但尚未穿透黏膜肌层，仍局限在黏膜层。模型组存活的7只小鼠全部发生肿瘤，肿瘤发生率为100%，给药组的肿瘤发生率虽然也为100%，但苦参碱和氧化苦参碱均能延缓肿瘤的发生程度，使肿瘤的发展停留在低级上皮内瘤变，降低高级上皮内瘤变的发生率。结果见表 2。

图 1 小鼠结直肠组织HE染色Fig.1 HE staining of colorectum tissue of mice

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠结直肠肿瘤的发生率及结直肠组织PCNA免疫组化分析结果 Table 2 Incidence of colorectal carcinoma and results of PCNA immunohistochemistryof colorectum tissue of mice in each group 组别 发生肿瘤动物数/总动物数 PCNA平均吸光度值 (x±s,n = 7) 总体 低级上皮内瘤变 高级上皮内瘤变 对照 0/8 0/8 0/8 0.06±0.04 模型 7/7 2/7 7/7 0.48±0.24 苦参碱 7/7 7/7 4/7 0.27±0.07 氧化苦参碱 7/7 7/7 3/7 0.26±0.09

表 2 各组小鼠结直肠肿瘤的发生率及结直肠组织PCNA免疫组化分析结果 Table 2 Incidence of colorectal carcinoma and results of PCNA immunohistochemistryof colorectum tissue of mice in each group

PCNA的表达与细胞增殖紧密相关，其阳性表达主要位于细胞核内，呈棕黄色或者棕褐色，见图 2和表 2。与对照组相比，模型组小鼠结直肠组织中PCNA阳性表达显著，在给以苦参碱和氧化苦参碱后其阳性表达显著降低。表明苦参碱与氧化苦参碱抑制结直肠癌的发生发展过程与抑制肿瘤的增殖有关。

图 2 小鼠结直肠组织中PCNA的阳性表达Fig.2 Expression of PCNA in colorectal tissues of mice

如图 3和表 3所示，模型组COX-2、iNOS、γH2AX、NF-κB P65、P53的蛋白表达量均显著增加（P＜0.05），在给予苦参碱和氧化苦参碱后COX-2、iNOS、γH2AX、NF-κB P65、P53的蛋白表达量均显著降低（P＜0.05、0.01）。

图 3 各组小鼠结直肠组织中COX-2、iNOS、NF-κB P65、P53和γH2AX蛋白表达情况 Fig.3 Expression of COX-2,NF-κB,P65,P53,iNOS,and γH2AX in colorectal tissues of mice in each group

表 3(Table 3)

表 3 各组小鼠结直肠组织中COX-2、iNOS、NF-κB P65、P53、γH2AX蛋白的相对表达量 Table 3 Relative expression of COX-2,iNOS,NF-κB P65,P53,and γH2AX in colorectal tissues of mice in each group (x±s, n = 4) 组别 COX-2/β-actin iNOS/β-actin NF-κB P65/β-actin P53/β-actin γ-H2AX/β-actin 对照 0.122±0.037 0.139±0.029 0.198±0.038 0.161±0.025 0.138±0.051 模型 0.495±0.015 0.457±0.068 0.507±0.021 0.447±0.044 0.423±0.053 苦参碱 0.297±0.071## 0.290±0.062# 0.368±0.024# 0.285±0.050# 0.313±0.057# 氧化苦参碱 0.284±0.063## 0.251±0.015## 0.328±0.040# 0.244±0.033## 0.271±0.047## 与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group

表 3 各组小鼠结直肠组织中COX-2、iNOS、NF-κB P65、P53、γH2AX蛋白的相对表达量 Table 3 Relative expression of COX-2,iNOS,NF-κB P65,P53,and γH2AX in colorectal tissues of mice in each group

AOM/DSS模型能够模拟炎性肠病诱发结直肠癌的全过程，而被广泛用于研究炎症性肠病（IBD）相关性结直肠癌的癌变机制以及结直肠癌的化学预防研究，阐明化学预防药物的作用机制研究。本研究大体观察结果表明AOM/DSS诱发小鼠发生了结直肠肿瘤，使小鼠结直肠肠壁增厚、皱缩，结直肠水肿、缩短、质量增加，苦参碱和氧化苦参碱给药后能够明显降低结直肠的质量，抑制结直肠的缩短，减小肿瘤体积，减少肿瘤区域。免疫组化结果表明模型组小鼠结直肠组织中PCNA蛋白阳性表达增多，苦参碱和氧化苦参碱能减少PCNA的阳性表达，表明苦参碱与氧化苦参碱抑制结直肠癌的发生发展过程与抑制肿瘤的增殖有关。

COX-2、iNOS与前炎症因子的分泌有关，与肿瘤的发生和发展关系密切。NF-κB与肿瘤细胞的生长和增殖关系密切，被认为是癌症预防的一个重要靶点之一^{[18, 19]}。γH2AX被认为是DNA双链断裂的分子标志，是DNA双链断裂损伤感应的起始信号分子，将一系列DNA损伤反应蛋白募集到DNA损伤位点，形成DNA损伤反应功能复合物，启动DNA修复、细胞周期检查点等细胞损伤反应^[20]。P53基因是一个非常重要的抑癌基因。它与细胞周期蛋白结合形成复合体，抑制依赖细胞周期蛋白的相关激酶活性，使细胞停滞在G₁期，或者引起细胞程序死亡。当P53基因发生突变时，可导致稳定的蛋白质不能完成抑制细胞增殖的作用，并且促进细胞恶性转化，侵袭力增强，使P53基因由抑癌基因转化为原癌基因^[21]。本研究结果表明模型组小鼠结直肠组织中COX-2、iNOS、NF-κB P65、P53、γH2AX蛋白表达量均增加，苦参碱和氧化苦参碱给药后小鼠结直肠组织中COX-2、iNOS、NF-κB P65、P53、γH2AX蛋白表达量均显著降低。说明苦参碱和氧化苦参碱能够通过抑制COX-2、iNOS的表达，降低炎症反应，延缓肿瘤的发生发展；同时苦参碱与氧化苦参碱通过下调NF-κB而发挥作用；苦参碱和氧化苦参碱组的γH2AX蛋白表达降低，说明苦参碱与氧化苦参碱能够降低结直肠组织中DNA的损伤。在模型组中P53蛋白的表达量显著增加，说明在肿瘤组织中P53基因发生了突变，给予苦参碱和氧化苦参碱后，P53的蛋白表达量降低，说明苦参碱与氧化苦参碱能够减少P53蛋白的表达，可能与其抑制P53基因的突变有关。

本研究结果表明，苦参碱和氧化苦参碱都表现出对结直肠癌的预防作用，具体表现为能改善AOM/DSS模型小鼠便血、脱肛等症状，减缓肿瘤的发生程度，抑制细胞的增殖。其作用的分子机制与调节COX-2、iNOS、NF-κB P65、P53、γH2AX蛋白表达有关。

本研究中苦参碱与氧化苦参碱均没有减少结直肠癌的发生率，这可能与苦参碱和氧化苦参碱在结直肠组织中分布少，两者口服吸收后在结肠部位分布很少，其药理效应不与血药浓度直接相关，而与效应室-结肠的药物浓度呈良好相关^[22]。因此，在未来的研究中，可通过口服结肠靶向制剂的制备来提高苦参碱与氧化苦参碱在结直肠病灶部位的浓度，从而发挥其癌症化学预防的作用。