心脑康片是《中国药典》2015年版一部收载的品种，由丹参、制何首乌、赤芍、枸杞子等16味药材制成，具活血化瘀、通窍止痛功效，用于瘀血阻络所致的胸痹、眩晕，症见胸闷、心前区刺痛、眩晕、头痛；扩张血管，增加冠状动脉血流量。用于冠心病、心绞痛及脑动脉硬化症^[1]。

组方药材丹参的指标成分为丹参酮II_A，制何首乌的主要指标成分为大黄素和大黄素甲醚，赤芍的主要指标成分为芍药苷，葛根的主要指标成分为葛根素，川芎的主要指标成分为阿魏酸，红花的主要指标成分为山柰素，泽泻的主要指标成分为23-乙酰泽泻醇B，牛膝的主要指标成分为β-蜕皮甾酮，酸枣仁的主要指标成分为斯皮诺素，甘草的主要指标成分为甘草苷。目前，对于心脑康片中活性成分测定的研究较少^[2]。中成药的研究多基于多指标的控制，更能全面反映中成药的质量^{[3,4,5,6,7,8,9]}。《中国药典》2015年版中对于该中成药的定量测定方法以芍药苷为指标进行测定。本研究首次采用HPLC法同时测定心脑康片中丹参酮II_A、葛根素、β-蜕皮甾酮、甘草苷、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、山柰素、大黄素、细叶远志皂苷和23-乙酰泽泻醇B11种指标成分，以期为更全面地控制心脑康片的质量提供参考依据。

Finnigan Surveyor液相色谱仪，美国Finnigan公司；Mettler Toledo AB204-N电子天平，十万分之一，梅特勒-托利多仪器公司；KQ5200型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

对照品丹参酮II_A（批号110766-201520，质量分数98.9%）、葛根素（批号110752-201514，质量分数95.5%）、β-蜕皮甾酮（批号111638-201505，质量分数95.0%）、甘草苷（批号111610-201106，质量分数93.7%）、芍药苷（批号110736-201438，质量分数96.4%）、斯皮诺素（批号111869-201203，质量分数95.4%）、阿魏酸（批号110773-201313，质量分数99.6%）、山柰素（批号110861-201310，质量分数93.2%）、大黄素（批号110756-201512，质量分数98.7%）、细叶远志皂苷（批号111849-201504，质量分数95.6%）、23-乙酰泽泻醇B（批号111846-201504，质量分数99.0%），购于中国食品药品检定研究院。心脑康片，规格为每片0.25 g，为长春海外制药集团有限公司产品，批号为20150406、20150407、20150408、20150602、20150603、20150604。乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯，购自美国Sigma-Aldrich公司；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

精密称取丹参酮II_A、葛根素、β-蜕皮甾酮、甘草苷、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、山柰素、大黄素、细叶远志皂苷、23-乙酰泽泻醇B对照品适量，加80%甲醇制成质量浓度分别为141.211、79.452、102.628、20.471、60.381、202.014、20.374、10.627、39.572、101.478、20.481 μg/mL的混合对照品溶液，摇匀，即得。

取质量差异下的本品，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，称定质量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30min，取出，放冷，再称定质量，用稀乙醇（50%）补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

按工艺方法制备缺少丹参、制何首乌、赤芍、葛根、川芎、红花、泽泻、牛膝、酸枣仁和甘草的阴性样品，按“2.1.2”项方法制备阴性样品溶液。

色谱柱为InertSustain C₁₈柱（250 mm×4.6mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈（1∶1，A）-0.1%磷酸水溶液（B），体积流量0.9mL/min，梯度洗脱：0～10.0 min，80% B；10.0～20.0 min，80%～70% B；20.0～35.0 min，70%～50% B；35.0～50.0 min，50%～30% B；分段变波长测定：0～10.0 min为270nm，10.0～20.0 min为250 nm，20.0～28.0 min为230 nm，28.0～37.0 min为330 nm，37.0～40.0 min为254 nm，40.0～50.0 min为210 nm；柱温40 ℃；进样量10 μL。

分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按“2.2”项条件进样测定，考察系统适用性。在“2.2”项色谱条件下，各成分色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.5，且阴性无干扰。色谱图见图 1。

1-丹参酮IIA 2-葛根素 3-β-蜕皮甾酮 4-甘草苷 5-芍药苷 6-斯皮诺素 7-阿魏酸8-山柰素9-大黄素 10-细叶远志皂苷 11-23-乙酰泽泻醇B 1-tanshinone IIA2-puerarin 3-β-ecdysone4-liquiritin 5-paeoniflorin 6-spinosin7-ferulic acid 8-kaempferide9-emodin 10-tenuifolin 11-23-acetate alisol 图 1 混合对照品 (A)、供试品 (B)与阴性样品 (C) 溶液的HPLC图Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A), sample (B), and negative sample (C)

精密吸取“2.1.1”项下制备的混合对照品溶液，制成6个不同质量浓度的对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定。记录相应的峰面积，以峰面积积分值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线并进行回归计算。11种成分的线性回归方程分别为丹参酮II_A：Y＝345.1X-5.672 1，r＝0.9996，线性范围28.24～282.42 μg/mL；葛根素：Y＝557.4 X＋58.23 8，r＝0.999 4，线性范围15.89～158.90μg/mL；β-蜕皮甾酮：Y＝81.27X＋372.71，r＝0.999 4，线性范围20.53～205.26 μg/mL；甘草苷：Y＝3.614X＋72.513，r＝0.999 5，线性范围4.09～40.94 μg/mL；芍药苷：Y＝11.284X＋58.247，r＝0.999 8，线性范围12.08～120.76μg/mL；斯皮诺素：Y＝44.667X＋365.23，r＝0.999 5，线性范围40.03～404.30μg/mL；阿魏酸：Y＝384.2X＋55.634，r＝0.999 6，线性范围4.08～40.75 μg/mL；山柰素：Y＝32.11X＋644.23，r＝0.999 2，线性范围2.13～21.25 μg/mL；大黄素：Y＝59.28X＋1.375，r＝0.999 3，线性范围7.91～79.14 μg/mL；细叶远志皂苷：Y＝582.1X＋33.62，r＝0.999 4，线性范围20.3～202.96 μg/mL；23-乙酰泽泻醇B：Y＝73.27X＋22.631，r＝0.999 7，线性范围4.10～40.96μg/mL；结果表明11种被测成分在标准曲线范围内质量浓度与峰面积线性关系良好。

取批号20150604样品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下连续进样6次，记录峰面积。结果丹参酮II_A、葛根素、β-蜕皮甾酮、甘草苷、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、山柰素、大黄素、细叶远志皂苷、23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD值分别为0.87%、0.81%、0.92%、0.56%、0.83%、0.95%、0.46%、0.58%、0.64%、0.79%、0.48%，结果表明精密度良好。

取批号20150604样品，按照“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，在“2.2”项色谱条件下进样分析，计算丹参酮II_A、葛根素、β-蜕皮甾酮、甘草苷、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、山柰素、大黄素、细叶远志皂苷、23-乙酰泽泻醇B质量分数RSD值分别为0.99%、1.11%、1.22%、1.06%、0.85%、0.91%、1.32%、1.28%、1.14%、1.21%、1.37%，结果表明重复性良好。

取精密度试验下供试品溶液，分别于0、2、6、8、12、24 h在“2.2”项色谱条件下进样分析，丹参酮II_A、葛根素、β-蜕皮甾酮、甘草苷、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、山柰素、大黄素、细叶远志皂苷、23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD值分别为0.65%、0.98%、0.71%、0.62%、0.77%、0.63%、1.18%、1.62%、1.39%、1.11%、1.28%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

取批号20150604样品9份，每份约0.5g，精密称定，分成3组，分别按已知质量分数的50%、100%、150% 3个水平加入混合对照品溶液，按照“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液，进样分析，计算回收率。丹参酮II_A、葛根素、β-蜕皮甾酮、甘草苷、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、山柰素、大黄素、细叶远志皂苷、23-乙酰泽泻醇B的平均回收率分别为98.15%、99.34%、100.24%、98.93%、101.64%、99.22%、98.43%、101.84%、101.27%、101.31%、99.81%，RSD值分别为1.11%、1.23%、1.47%、0.84%、0.75%、1.05%、0.62%、1.37%、0.99%、0.77%、1.71%，表明本方法准确度良好。

取6批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以外标法计算各成分的质量分数，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 6批心脑康片中11种成分定量测定结果 Table 1 Quantitative determination of eleven components in six batches of Xinnaokang Tablets 批号 质量分数/(mg∙g−1) 丹参酮IIA 葛根素B 阿魏酸 β-蜕皮甾酮 甘草苷 芍药苷 斯皮诺素 山柰素 大黄素 细叶远志皂苷 23-乙酰泽泻醇 20150406 0.887 6.321 0.865 0.176 0.375 2.136 0.095 0.154 0.117 1.378 0.103 20150407 0.871 6.324 0.862 0.171 0.373 2.129 0.099 0.155 0.113 1.373 0.101 20150408 0.876 6.327 0.859 0.173 0.370 2.134 0.089 0.148 0.115 1.371 0.105 20150602 0.870 6.325 0.857 0.179 0.377 2.133 0.088 0.158 0.121 1.380 0.105 20150603 0.883 6.329 0.861 0.177 0.377 2.136 0.096 0.149 0.120 1.372 0.108 20150604 0.881 6.325 0.866 0.174 0.369 2.128 0.093 0.151 0.114 1.371 0.109

表 1 6批心脑康片中11种成分定量测定结果 Table 1 Quantitative determination of eleven components in six batches of Xinnaokang Tablets

本实验首次建立了HPLC法同时测定心脑康片中11种成分的分析方法。通过二极管阵列检测器，根据11种成分不同的紫外吸收行为，分段波长检测的方法对11种成分进行测定，丹参酮II_A的检测波长为270nm，葛根素、β-蜕皮甾酮、甘草苷的检测波长为250 nm，芍药苷的检测波长为230 nm，斯皮诺素、阿魏酸、山柰素的检测波长为330 nm，大黄素的检测波长为254 nm，细叶远志皂苷与23-乙酰泽泻醇B的检测波长为210 nm。由于各个化学成分的极性差异比较大，本实验采用梯度洗脱的方式来保证各个成分能得到有效分离，同时筛选了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水、甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水、甲醇-乙腈-磷酸水等多个流动相体系；多个型号的C₁₈色谱柱，最终确定了本实验中的色谱条件。本法快速、灵敏度高、准确度高、专属性好，为心脑康片的质量控制提供依据。