现代发酵工程技术已广泛应用于茯苓等药用真菌的液体发酵，茯苓高密度液体发酵有望推动其工业化生产的进程，确保其产品质量，对于其资源和生态环境的保护有重要意义。茯苓发酵罐补料液体发酵是实现其高密度液体发酵的有效方式。补料液中碳氮源浓度将显著地影响茯苓胞外多糖和菌丝体的产量。与营养培养基相比，添加适量中药材的药性培养基中的化学成分可有效调控药用真菌的生长代谢，从而影响其液体发酵水平的高低^[1,2,3]。本实验分别以营养培养基、添加薏苡仁的药性培养基、添加薏苡仁和枸杞子的复合药性培养基为初始发酵培养基，开展茯苓发酵罐补料液体发酵的研究，优化其发酵工艺。同时，比较了天然茯苓（野生采收）、发酵茯苓（营养培养基中液体发酵）、药性发酵茯苓（药性培养基中液体发酵）和复合药性发酵茯苓（复合药性培养基中液体发酵）等不同茯苓的总糖、多糖、灰分、氨基酸和微量元素的差异，为茯苓等药用真菌资源的科学开发与利用奠定基础。

Bioflo III型发酵罐，NBS公司；全温振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；超净工作台，苏净集团安泰公司；GGX-9火焰原子吸收光谱仪，北京地质仪器厂；J2-HS型离心机，Beckman公司；WOS-20型无油空气压缩机，天津天伟医疗器械有限公司；SX2-4-10箱式电阻炉，沈阳市节能炉厂；L-8800全自动氨基酸分析仪，Hitachi公司；BP121S型电子天平，Sartorius公司。

蛋白胨、酵母浸膏购自Oxoid；葡萄糖对照品购自中国食品药品检定研究院（质量分数＞99.9%，批号111648-200406）；苯酚（重蒸）；18.3 MΩ高纯水，微量元素定量测定用；实验用其他试剂均采用国产分析纯。实验所用中药材均购自成都杏林大药房，样品经成都医学院游元元博士鉴定为薏苡仁Coix lacryma-jobi L.var.mayuen(Roman.)Stapf和枸杞子Lycium barbarum L.。

葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母浸膏4 g，K₂HPO₄1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，初始pH值5.5，蒸馏水1 L。1.05 kg/cm²，121.3 ℃灭菌20min。

葡萄糖100 g，蛋白胨11.25 g，酵母浸膏8.75 g，K₂HPO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O2.5 g，初始pH值5.5，蒸馏水4.05 L。1.05 kg/cm²，121.3 ℃灭菌20 min。

薏苡仁37.5 g，其余同“1.2.2”项营养培养基。

薏苡仁18.75 g，枸杞子18.75 g，其余同“1.2.2”项营养培养基。

A液：葡萄糖100 g，蒸馏水300 mL。B液：蛋白胨11.25 g，酵母浸膏8.75 g，蒸馏水300 mL。将A液和B液于0.56 kg/cm²，112.6 ℃分别灭菌30 min，冷却至室温后，将A液和B液无菌混和均匀。

将1.75 mL冷冻甘油菌P6（成都医学院生药学教研室筛选保存）接种于350 mL种子培养基中，25 ℃摇瓶振荡培养2 d。

罐补料液体发酵在火焰保护下，将350mL种子液接种于发酵培养基中。设定发酵参数：温度26 ℃，pH值5.5，搅拌转速和通气量根据溶氧高低而动态调整。在茯苓发酵罐液体发酵的第48、60、72、84小时，蠕动泵分4次将补料培养基100、200、200、100 mL滴加于发酵液中。第120小时终止茯苓液体发酵。

罐补料液体发酵在火焰保护下，将350mL种子液接种于发酵罐药性培养基中，其余同“1.4.1”项，以营养培养基为初始培养基的发酵罐补料液体发酵。

罐补料液体发酵在火焰保护下，将350 mL种子液接种于发酵罐复合药性培养基中，其余同“1.4.1”项，以营养培养基为初始培养基的发酵罐补料液体发酵。

在茯苓液体发酵108～130 h，每隔2 h取样，测定发酵液中胞外多糖和菌丝体干质量。综合考虑胞外多糖和菌丝体产量以确定发酵终点。

胞外多糖纯化与称量参照文献方法^[4]。

用离心机6 000 r/min离心发酵液15 min，收集菌丝体沉淀，60 ℃烘干至恒定质量，用电子天平精确称量。

参照文献方法^[5]测定茯苓样品中总糖。

参照文献方法^[6]进行茯苓水溶性多糖和碱溶性多糖的的提取分离及测定。

按中华人民共和国国家标准GB/T5009.124-2003测定样品氨基酸。

参照文献方法^[7]测定样品微量元素。

按中华人民共和国国家标准GB/T 8306-2002测定样品总灰分，按中华人民共和国国家标准GB/T8307-2002测定样品水溶性灰分，按中华人民共和国国家标准GB/T 8308-2002测定样品酸不溶性灰分。

实验数据分析均采用统计学软件SPSS13.0。实验数据以x±s表示，P＜0.05为统计学意义上具有显著差异性。

不同初始发酵培养基对茯苓发酵罐补料液体发酵的影响见表 1。以复合药性培养基为初始发酵培养基的发酵罐复合药性补料液体发酵的胞外多糖产量最高，达8.33 g/L；以药性培养基为初始发酵培养基的发酵罐药性补料液体发酵的菌丝体干质量最高，达15.03 g/L。综合考虑胞外多糖和菌丝体产量，认为以复合药性培养基为初始发酵培养基的发酵罐补料液体发酵是一种较优的发酵方式。

表 1(Table 1)

表 1 不同初始发酵培养基对茯苓发酵罐补料液体发酵的影响(x± s ,n=3) Table 1 种类 胞外多糖/(g∙L−1) 菌丝体干质量/(g∙L−1) 营养培养基 5.56±0.08 12.53±0.11 药性培养基 7.45±0.08 15.03±0.16 复合药性培养基 8.33±0.12 14.75±0.08 与营养培养基组比较：*P＜0.05 *P< 0.05 vs nutrition medium group

表 1 不同初始发酵培养基对茯苓发酵罐补料液体发酵的影响(x± s ,n=3) Table 1 Effects of different fermentation time on compound medicinal additional liquid fermentation of P. cocos in fermentor(x± s ,n=3)

发酵时间对发酵罐复合药性补料液体发酵的影响见表 2。发酵第124小时，胞外多糖产量最高，达8.47 g/L；发酵第116小时，菌丝体干质量最高，达14.85 g/L。以胞外多糖和菌丝体产量为评价指标，综合考虑发酵成本，认为120h是发酵罐复合药性补料液体发酵的最佳发酵终点，胞外多糖产量达8.37 g/L，菌丝体干质量达14.70 g/L。

表 2(Table 2)

表 2 发酵时间对茯苓发酵罐复合药性补料液体发酵的影响(x± s ,n=3) Table 2 Effects of different fermentation time on compound medicinal additional liquid fermentation of P. cocos in fermentor(x± s ,n=3) 发酵时间/h 胞外多糖/(g∙L−1) 菌丝体干质量/(g∙L−1) 108 5.37±0.06 13.62±0.14 110 5.74±0.07 14.11±0.11 112 6.22±0.08 14.40±0.12 114 6.77±0.08 14.64±0.10 116 7.34±0.09 14.85±0.11 118 7.83±0.05 14.75±0.11 120 8.37±0.07 14.70±0.11 122 8.43±0.08 14.66±0.06 124 8.47±0.10 14.49±0.10 126 8.38±0.06 14.29±0.08 128 8.28±0.08 13.99±0.15 130 8.23±0.10 13.59±0.14

表 2 发酵时间对茯苓发酵罐复合药性补料液体发酵的影响(x± s ,n=3) Table 2 Effects of different fermentation time on compound medicinal additional liquid fermentation of P. cocos in fermentor(x± s ,n=3)

不同来源茯苓中总糖和多糖测定结果见表 3。天然茯苓总糖质量分数85.76%和总多糖质量分数82.25%均远高于发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓，而茯苓总糖和总多糖质量分数在发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓之间的差别却不大。另外，虽然发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓中碱溶性茯苓多糖的比例远低于天然茯苓，但其水溶性茯苓多糖的比例却远高于天然茯苓。

表 3(Table 3)

表 3 不同来源茯苓样品中总糖和总多糖测定结果(x± s ,n=3) Table 3 Determination of polysaccharides and total saccharides in different sources of Poria(x± s ,n=3) 样品 总糖/% 水溶性茯苓多糖/% 碱溶性茯苓多糖/% 总多糖/% 天然茯苓 85.76±0.54 2.41±0.09 79.79±0.36 82.25±0.50 发酵茯苓 44.83±0.36 6.86±0.10 17.68±0.18 24.55±0.13 药性发酵茯苓 45.66±0.48 7.25±0.07 18.73±0.19 25.94±0.20 复合药性发酵茯苓 45.95±0.36 7.11±0.07 18.76±0.13 25.88±0.20

表 3 不同来源茯苓样品中总糖和总多糖测定结果(x± s ,n=3) Table 3 Determination of polysaccharides and total saccharides in different sources of Poria(x± s ,n=3)

不同来源茯苓中氨基酸测定结果见表 4。发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓中所含有的蛋氨酸、组氨酸和精氨酸在天然茯苓中未检测出。天然茯苓总氨基酸较低，仅为1.48%；而发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓总氨基酸却分别高达25.54%、21.34%和21.32%。认为这可能与发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓的培养基中氮源浓度远高于天然茯苓的培养基中氮源浓度及发酵方式的差异有关。

表 4(Table 4)

表 4 不同来源茯苓样品中氨基酸测定结果(x± s ,n=3) Table 4 Determination of amino acids in different sources of Poria(x± s ,n=3) 样品 总氨基酸/% 丙氨酸/% 缬氨酸/% 亮氨酸/% 异亮氨酸/% 蛋氨酸/% 天冬氨酸/% 谷氨酸/% 赖氨酸/% 天然茯苓 1.48±0.03 0.05±0.00 0.54±0.03 0.13±0.00 0.10±0.00 0.00±0.00 0.07±0.00 0.07±0.00 0.00±0.00 发酵茯苓 25.54±0.59 1.77±0.09 2.52±0.19 1.64±0.14 1.07±0.06 0.63±0.02 2.17±0.12 2.80±0.17 1.91±0.23 药性发酵茯苓 21.34±0.78 1.40±0.14 2.13±0.10 1.27±0.12 1.01±0.04 0.58±0.02 1.78±0.14 2.31±0.16 1.32±0.08 复合药性发酵茯苓 21.32±0.19 1.49±0.07 2.14±0.16 1.32±0.10 0.92±0.05 0.59±0.04 1.83±0.14 2.27±0.16 1.29±0.12 样品 精氨酸/% 甘氨酸/% 丝氨酸/% 苏氨酸/% 脯氨酸/% 苯丙氨酸/% 酪氨酸/% 组氨酸/% 脯氨酸/% 天然茯苓 0.00±0.00 0.03±0.00 0.06±0.01 0.04±0.00 0.04±0.00 0.10±0.00 0.09±0.00 0.00±0.00 0.04±0.00 发酵茯苓 1.47±0.09 1.39±0.09 0.95±0.04 1.13±0.08 2.54±0.22 1.19±0.11 0.83±0.06 0.81±0.02 2.54±0.22 药性发酵茯苓 1.22±0.04 0.96±0.06 0.80±0.05 1.11±0.08 2.27±0.16 1.13±0.05 0.71±0.04 0.62±0.02 2.27±0.16 复合药性发酵茯苓 1.14±0.06 1.00±0.04 0.83±0.03 1.17±0.08 2.13±0.18 1.14±0.05 0.67±0.02 0.63±0.02 2.13±0.18 与天然茯苓组比较：*P＜0.05；天然茯苓中赖氨酸的量为0.0023% *P< 0.05 vs natural Poria guoup; lysine in naturalPoria was 0.0023%

表 4 不同来源茯苓样品中氨基酸测定结果(x± s ,n=3) Table 4 Determination of amino acids in different sources of Poria(x± s ,n=3)

不同来源茯苓中微量元素测定结果见表 5。除Cr和Cd外，天然茯苓中其他微量元素的量均高于发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓，但不同来源茯苓间微量元素的量差异不大，且不同来源茯苓间元素的量从高到低的次序（K＞Mg＞Ca＞Fe＞Mn＞Cu＞Zn＞Pb＞Cr＞Cd）也一致。不同来源茯苓中K的量最高，天然茯苓、发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓间微量元素的量分别为660.5、572.4、634.3、621.9 μg/g；不同来源茯苓中Cr的量较低，均为0.2 μg/g。

表 5(Table 5)

表 5 不同来源茯苓样品中微量元素测定结果(x± s ,n=3) Table 5 Determination of trace elements in different sources of Poria(x± s ,n=3) 样品 质量分数/(μg∙g−1) K Mg Ca Fe Mn Cu Zn Pb Cr Cd 天然茯苓 660.5±18.2 104.5±3.8 58.3±1.1 41.9±0.6 12.7±0.2 5.7±0.0 2.8±0.0 0.6±0.0 0.2±0.0 0.0±0.0 发酵茯苓 572.4±13.6 98.1±1.8 51.8±0.8 38.7±0.6 10.2±0.2 5.4±0.0 1.7±0.0 0.5±0.0 0.2±0.0 0.0±0.0 药性发酵茯苓 634.3±11.4 103.6±2.2 53.7±0.3 40.9±0.6 11.4±0.2 5.6±0.1 2.3±0.0 0.5±0.0 0.2±0.0 0.0±0.0 复合药性发酵茯苓 621.9±16.3 102.4±2.2 55.4±0.8 40.6±0.4 11.3±0.2 5.5±0.0 2.3±0.0 0.5±0.0 0.2±0.0 0.0±0.0 不同茯苓中Cd元素为0.01 mg/g The contents of Cd in different sources of Poria were 0.01mg/g

表 5 不同来源茯苓样品中微量元素测定结果(x± s ,n=3) Table 5 Determination of trace elements in different sources of Poria(x± s ,n=3)

不同来源茯苓中灰分测定结果见表 6。不同茯苓间水溶性灰分差异较小，而酸不溶性灰分差异却较大。天然茯苓的总灰分远低于发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵的总灰分。导致天然茯苓和发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵间酸不溶性灰分和总灰分测量值间偏差较大原因可能是发酵方式的不同。

表 6(Table 6)

表 6 不同来源茯苓样品中灰分测定结果(x± s ,n=3) Table 6 Determination of ashes in different sources of Poria(x± s ,n=3) 样品 总灰分/% 水溶性灰分/% 酸不溶性灰分/% 天然茯苓 0.233±0.008 0.089±0.006 0.101±0.008 发酵茯苓 5.900±0.181 0.041±0.006 0.823±0.014 药性发酵茯苓 4.833±0.185 0.059±0.005 0.622±0.008 复合药性发酵茯苓 4.720±0.015 0.063±0.005 0.615±0.007 与天然茯苓组比较：*P＜0.05 *P< 0.05 vs natural Poria group

表 6 不同来源茯苓样品中灰分测定结果(x± s ,n=3) Table 6 Determination of ashes in different sources of Poria(x± s ,n=3)

茯苓液体发酵中碳氮源浓度过高或过低都将抑制茯苓的生长，根据液体发酵中碳氮源消耗速率来动态补充碳氮源是一个好的策略。不同中药材所含化学成分不同，对茯苓生长代谢有促进或抑制作用。筛选适宜的中药材添加到营养培养基组成药性培养基，所添加中药材中的化学成分可提高茯苓液体发酵的水平。研究发现薏苡仁、枸杞子薏苡仁、枸杞子、灵芝、甘草、桑叶和淡竹叶等6味中药材对茯苓生长有促进作用^[8]。复合药性培养基较药性培养基的化学成分更加复杂，在将发酵培养基高温灭菌的过程中还可能产生新的化学成分，通过其多种化学成分间协同作用来提高茯苓液体发酵水平的作用机理尚难以阐明。笔者研究发现，将薏苡仁和枸杞子粉末（薏苡仁-枸杞子1∶1）按0.75%比例加入营养培养基中组成复合药性培养基，可较大地提高胞外多糖和菌丝体的产量^[9]。

由于生产天然茯苓、发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓的培养基所含营养成分的差异，特别是碳氮源种类和浓度的差异，加之培养基中所含药性成分的不同和发酵方式的差异，使不同茯苓中的化学成分（如茯苓胞外多糖多糖、胞内多糖、氨基酸、微量元素）有较大差异性。天然茯苓中总糖和总多糖远高于发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓中总糖和总多糖，而天然茯苓中总氨基酸却远高低于发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓中总氨基酸。茯苓多糖和三萜类化合物是茯苓的主要活性化合物，具有显著的抗肿瘤、提高免疫功能等药理作用^[10,11,12]。

另外，茯苓中氨基酸、微量元素对于发挥其健脾宁心、利水渗湿的功效可能起着重要作用。例如，K对调节人体组织及细胞中的酸碱平衡，降低人体血压有益；Mg对调节神经肌肉的兴奋，维持人体骨骼和牙齿的正常生长和体温调节都有重要作用；Mn是人体内多种酶的组成成分和激活物，有抗衰老和预防癌症作用；锌对部分细菌和病毒有抑制作用，能增强人体免疫力。今后，应加强茯苓液体发酵的发酵动力学研究^[13,14]，有效实现茯苓补料高密度液体发酵的动态调控，从而大幅度地提高其液体发酵水平和质量。另外，积极开展茯苓多糖和三萜类化合物等活性成分的结构鉴定和药效学评价的研究，以进一步揭示其药效的物质作用基础，并不断完善茯苓的质量评价标准，实现茯苓资源的高效开发与有效利用。