具有清肺利咽、止血的功效，是一种用于解毒、消肿的药用真菌，更是一种止血良药^[2]。马勃中所含化学成分主要为萜类化合物、甾体化合物、马勃多糖、小分子的含氮化合物等^[3]，经过调查和文献研究，近年来对马勃中甾体类成分的测定研究还不够深入，而甾体类成分具有较强的生理活性。马勃中的主要成分之一麦角甾醇（ergosterol）是真菌类的特征甾醇，其主要存在于绝大多数的真菌细胞膜中，据报道麦角甾醇的量与真菌的生物量存在着相关关系，是真菌生物量的重要标志物之一^{[4, 5]}。麦角甾醇是甾醇化合物的一种，为脂溶性维生素D2的前体^[6]，其具有抗癌、防衰老、减毒等功能^[7]。麦角甾醇作为真菌类的特征甾醇，在马勃的研究中却很少受到关注。本实验旨在以麦角甾醇为测定指标，建立马勃质量评价的HPLC测定方法；并对不同品种和不同产地的马勃样品中的麦角甾醇进行了测定和质量比较研究，为马勃的进一步研究和开发利用提供参考。

美国Water 2695高效液相色谱系统，Water 2996 UV检测器；Empower数据管理系统；Lab Teach UV-2000紫外可见分光光度计（菲勒仪器）；BDS HYPERSIL C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；DHG-9023A型电热恒温鼓风式干燥箱（上海精宏实验设备厂）；KH-500型超声波清洗仪器（昆山禾创仪器公司）；HH-数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器公司）；EPED超纯水系统（南京EPED科技有限公司）。

样品经笔者鉴定为灰包科脱皮马勃Lasiosphoera fenzlii Reich、大马勃Calvatia gigantea (Batsch ex Pers.) Lloyd、栓皮马勃Mycenastrum corium (Guers.) Dcsv.或紫色马勃C. lilacina (Mont. et Berk.) Lloyd的干燥子实体；伪品经鉴定为大口静灰球Bovistella sinensis Lloyd、长根静灰球Bovistella radicata(Mont.) Pat的干燥子实体，样品信息见表 1。麦角甾醇对照品（批号为111845-201403），质量分数为95.50%，购自中国食品药品检定研究院。乙腈（色谱纯，德国默克公司）；醋酸乙酯（分析纯，上海试四赫维化工）；甲醇（分析纯，南京化学试剂公司）；水为实验室自制超纯水。

表 1 (Table 1)

表 1 样品信息 Table 1 Information of LSC samples 编号 种名及产地 编号 种名及产地 编号 种名及产地 编号 种名及产地 1 大马勃（安国） 12 大马勃（亳州） 23 长根静灰球（河北） 33 大马勃（河北） 2 大马勃（安国） 13 栓皮马勃（河北） 24 长根静灰球（河北） 34 大马勃（河北） 3 大马勃（安国） 14 大马勃（河北） 25 大马勃（河北） 35 大马勃（河北） 4 大马勃（安国） 15 大马勃（河北） 26 大马勃（河北） 36 大马勃（河北） 5 大马勃（安国） 16 脱皮马勃（河北） 27 大马勃（河北） 37 大马勃（河北） 6 大马勃（安国） 17 大口静灰球（河北） 28 大马勃（河北） 38 大马勃（河北） 7 大马勃（安国） 18 大马勃（河北） 29 大马勃（河北） 39 大马勃（河北） 8 大马勃（安国） 19 大马勃（河北） 30 大马勃（河北） 40 大马勃（吉林） 9 大马勃（安国） 20 大马勃（河北） 31 大马勃（河北） 41 紫色马勃（吉林） 10 大马勃（安国） 21 大马勃（河北） 32 大马勃（河北） 42 大马勃（内蒙古） 11 大马勃（安国） 22 大口静灰球（河北）

表 1 样品信息 Table 1 Information of LSC samples

BDS HYPERSIL C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；体积流量1.0 mL/min；检测波长282 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱：0～15 min，95% A，15～50 min，100% A。

精密称取麦角甾醇对照品2.06 mg，4 mL甲醇溶解并定容，其质量浓度为0.515 mg/mL，作为对照品溶液。

将干燥的马勃药材粉碎，过20目筛。精密称取1.000 g 样品，置50 mL具塞锥形瓶中，加醋酸乙酯30 mL溶解，45 ℃恒温水浴30 min，超声30 min，抽滤，取滤液，置蒸发皿中蒸干，加2 mL甲醇溶解，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，进行HPLC分析。

分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液，按“2.1.1色谱条件”项下的测定方法进行测定。其HPLC色谱图见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 麦角甾醇对照品 (A) 和马勃供试品 (B) 溶液的HPLC 色谱图 Fig. 1 HPLC of ergosterol reference substance (A) and LSC (B)

取0.515 mg/mL对照品溶液，分别进样2、5、10、15、18、20、25 μL，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。计算得回归方程Y＝1.6×10⁶ X＋72 996。结果表明，马勃中麦角甾醇的量在1.030～12.875 μg呈现良好的线性关系。

精密吸取0.515 mg/mL对照品溶液20 μL，连续进样6次，分别测定和记录其峰面积值，计算RSD值为0.33%。

精密吸取16号样品供试品溶液20 μL，分别测定其在0、2、4、6、12、18 h内的峰面积值，计算在18 h内麦角甾醇的RSD值为0.91%。表明样品溶液在室温下稳定性良好。

精密称取16号样品的供试品6份，按“2.1.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，测定其麦甾醇的峰面积值，计算质量分数RSD值为0.48%。

精密量取6份已测定的马勃供试品溶液，分别精密加入一定量的麦角甾醇对照品溶液，按“2.1.1”项下方法测定加样回收率，经计算其回收率在99.6%～100.4%，RSD值为0.96%，满足定量分析的要求。

取不同产地不同品种的马勃粉末1.000 g，精密称定，按“2.1.3”项供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件的方法测定其中麦角甾醇的量，以外标一点法计算样品中麦角甾醇的量，见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 不同产地马勃中麦角甾醇的量 Table 2 Contents of ergosterol in LSC samples in various species from different producing areas 编号 麦角甾醇/% 编号 麦角甾醇/% 编号 麦角甾醇/% 编号 麦角甾醇/% 1 0.059 4 12 0.012 1 23 0.039 9 34 0.028 7 2 0.024 4 13 0.116 3 24 0.025 6 35 0.022 8 3 0.056 9 14 0.111 9 25 0.025 1 36 0.038 2 4 0.040 4 15 0.028 0 26 0.012 4 37 0.017 7 5 0.012 3 16 0.009 9 27 0.034 2 38 0.030 6 6 0.017 2 17 0.032 5 28 0.013 0 39 0.020 3 7 0.038 6 18 0.150 3 29 0.018 7 40 0.064 6 8 0.022 6 19 0.077 6 30 0.033 1 41 0.050 2 9 0.061 8 20 0.097 0 31 0.028 2 42 0.023 5 10 0.030 6 21 0.015 6 32 0.027 0 11 0.020 1 22 0.048 0 33 0.038 3

表 2 不同产地马勃中麦角甾醇的量 Table 2 Contents of ergosterol in LSC samples in various species from different producing areas

采用“SPSS 15.0 for Windows”软件进行系统聚类分析，以不同产地的42个马勃样品中麦角甾醇量为研究对象。原始数据经标准化变换后，选用组间距离法（between groupslinkage）进行聚类，系统聚类结果见图 2，散点图分析42批马勃样品见图 3。由图 2分析结果表明，同一个产地且相同品种的马勃样品距离最近，聚为一类；不同产地的同一品种马勃样品距离较近；不同产地且不同品种的样品距离则较远。因此可得出产地对麦角甾醇量的影响并不显著，但是不同品种的马勃中麦角甾醇量差异比较明显。由散点图可看出，来自河北某中医院的马勃样品为13、14、18、20的品种，其量相对较高，其中13、14号经鉴定为栓皮马勃和大马勃；而其他品种的马勃中麦角甾醇的量相对较接近。

图 2

Fig. 2

图 2 不同品种和产地马勃样品麦角甾醇量聚类分析图 Fig. 2 Cluster analysis of contents of ergosterol in LSC samples from different habitats areas and species

图 3

Fig. 3

图 3 不同品种和产地马勃样品麦角甾醇量散点图 Fig. 3 Scatter plot of contents of ergosterol in LSC samples from different habitats areas and species

精密称取马勃样品1 g加醋酸乙酯30 mL，恒温水浴15 min，超声15 min，或水浴30 min和超声30 min，抽滤，取滤液蒸干，2 mL甲醇复溶，过0.45 μm滤膜，进样分析。实验结果表明，加长水浴和超声时间可提高麦角甾醇的提取量。

同时采用石油醚、醋酸乙酯、甲醇、乙醇4种溶剂处理同一种的马勃样品，结果表明采用醋酸乙酯为提取溶剂时的麦角甾醇提取效率最高，乙醇提取次之，故选择醋酸乙酯为提取溶剂。

考察了采用不同比例（100∶0、95∶5）乙腈-水为流动相，100%乙腈为流动相时，麦角甾醇与其他成分完全分离，但峰拖尾较严重，且麦角甾醇的保留时间较靠后。因此将水改成0.1%的甲酸水，这样可有效防止拖尾。综合各种因素，最终确定乙腈和0.1%甲酸水为适宜的流动相。

分别考察了（100∶0、95∶5）乙腈-0.1%甲酸水等度洗脱的图谱，最后选用以乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）为流动相进行梯度洗脱：0～15 min，95% A；15～50 min，100% A。结果表明梯度洗脱效果较好。

马勃属于真菌类，而麦角甾醇又是真菌类的特征甾醇，因此有必要建立马勃中麦角甾醇的质量评价方法。据文献报道真菌中含有游离麦角甾醇及麦角甾醇酯^[8]。本实验观察到，溶液中的麦角甾醇易发生降解，这与Mille-Lindblom等^[9]研究结果一致。因此，麦角甾醇标准品及其供试品溶液均应避光、低温保存，且样品制备后需立即测定，保存时间不宜过长，但是Mille-Lindblom等^[9]研究同时也表明，生物体中麦角甾醇量稳定，可以麦角甾醇为生物指标对真菌进行测定^[10]。麦角甾醇的生物学作用研究较少，是今后值得研究的方向。