蜘蛛香Valerianae Rhizoma为败酱科（Valerianaceae）缬草属Valerianae L. 植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones 的干燥根茎和根，主产于云南、贵州、四川等地，具有疏散风热、利咽、透疹、明目退翳、解痉等作用；主要用于治疗风热感冒、眼痛音哑、麻疹不透、风疹瘙痒、目赤翳障、惊风抽搐和破伤风^[1]。现代研究表明蜘蛛香还具有抗焦虑^[2]、抗氧化^[3]、抗痉挛^[4]和抗抑郁^[5]等作用。近年来研究发现蜘蛛香中具有镇静、安神和抗抑郁等作用的主要活性成分为缬草素类^[6]，并且其抗焦虑作用也有相关报道^[7]。本研究通过明暗箱、敞箱、高架十字迷宫和自发性活动实验观察小鼠行为学方面的表现，研究蜘蛛香提取物及蜘蛛香总缬草素的抗焦虑作用，为蜘蛛香的开发利用和临床应用提供科学依据。

ICR雄性小鼠，8周龄，体质量18～24 g，购买于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SCXK（沪）2014-0007。动物于20～24 ℃，湿度60%～70%，12 h/12 h明暗的环境中适应性饲养3 d后开始实验。

蜘蛛香药材购于贵州省贵阳市，经第二军医大学药学院生药学教研室秦路平教授鉴定为败酱科缬草属植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones 的干燥根及根茎。地西泮［批号130330，规格2.5 mg，江苏济川制药有限公司，购于上海长海医院（第二军医大学第一附属医院）］。

聚山梨酯-80、95%乙醇，上海国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS），上海增博生物科技有限公司；皮质酮、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）ELISA试剂盒（LDN，德国，购于上海BioTNT生物科技有限公司）。

RF-52C型旋转蒸发仪及循环水式多用真空泵SHB-IIIA（上海豫康科教仪器有限公司）；D101型大孔吸附树脂（天津振天成有限公司）；JLGY-1小鼠明暗箱实验视频分析系统、JLGY-1小鼠敞箱实验视频分析系统、JLGY-1小鼠高架十字迷宫实验视频分析系统、JLGY-1小鼠自发性活动实验视频分析系统（上海吉星生物仪器设备有限公司）；1-15K型台式高速冷冻离心机（上海安亭仪器厂）；酶联免疫检测仪（BIO- TEK，美国）；电动匀浆器（IKA，德国）；CO₂恒温培养箱（SANYO Electric Biomedical Corporation）。

取蜘蛛香药材1.6 kg，自然干燥后粉碎，过60目筛，用8倍量95%乙醇超声提取3次，每次1.5 h，减压回收试剂至基本无醇味，得到蜘蛛香提取物（138 g）。临用时以0.5%聚山梨酯-80和适量蒸馏水配制成混悬液。

准确称取60 g蜘蛛香药材粉末，将药材粉末用水浸泡24 h，8倍量95%乙醇渗滤提取，提取3次，收集渗滤液，35℃减压浓缩至50 mL浓缩液，将此浓缩液上样于预处理过的D101 300 mL大孔树脂柱上样后用8 BV的70%乙醇除杂后直接换用85%乙醇冲洗，收集85%部位的洗脱液，35 ℃减压浓缩，得浸膏，即为蜘蛛香总缬草素有效部位（含缬草素、chlorovaltrate、jatamanvaltrate P、jatamanvaltrate Q的质量分数之和为52.4%）。临用时以0.5%聚山梨酯-80和适量蒸馏水配制成混悬液。

将ICR小鼠随机分为8组：对照组（等量蒸馏水与聚山梨酯-80配制的混悬液），地西泮阳性对照组（2 mg/kg），蜘蛛香提取物低、中、高剂量（50、100、150 mg/kg，按提取物浸膏计）组，蜘蛛香总缬草素低、中、高剂量（30、60、90 mg/kg，按总缬草素有效部位浸膏计）组，每组10只。各组均ig给药，给药体积为20 mL/kg，每天1次，连续给药10 d。于末次给药1 h（地西泮给药0.5 h）后，于15︰00～23︰00进行行为学实验。所有实验小鼠饲养于第二军医大学动物房，温度为（24.0±0.5）℃，湿度为45%～50%，通风环境良好。

明暗箱实验装置（45 cm×27 cm×27 cm）包括明箱与暗箱2部分，2箱之间由一个带光电装置的区域分开，实验动物箱为1个聚丙烯塑料盒，明暗箱各占1半，2箱之间有一个7.5 cm×7.5 cm的门洞供动物穿过，将此聚丙烯塑料盒置于一带电装置的较大暗盒中，明箱上部照以亮光，实验开始时将小鼠置于明箱中央，背朝隔室，观察5 min内小鼠在明暗箱之间穿过的次数及在明箱中的滞留时间。

实验装置为1个正四边形聚丙烯塑料盒（45 cm×45 cm×45 cm×45 cm）；将此装置置于装有视频监控的较大暗盒中，实验时将小鼠置于敞箱中央，观察5 min内小鼠在中央区的停留时间。

高架十字迷宫包括2个50 cm×10 cm的相对开臂和2个50 cm×10 cm的相对闭臂，闭臂上部敞开，开臂四周均敞开，开臂与闭臂之间中央有一个10 cm×10 cm的相对开阔部。迷宫离地面高50 cm。将小鼠置于中央开阔部，头朝闭臂。观察者在离迷宫中心1 m以外记录5 min内小鼠进入开臂与闭臂的次数和在两臂滞留的时间（以四肢全部入臂或出臂为标准）。计算小鼠进入开臂的次数与时间分别占总次数（两臂次数之和）和总时间（在两臂滞留时间之和）的百分比（占比）。

实验装置类似于敞箱实验装置，为1个正四边形聚丙烯塑料盒（45 cm×45 cm×45 cm×45 cm）；将此装置置于装有视频监控的较大暗盒中，实验时先将小鼠放置于此实验装置中使其熟悉环境5 min，然后记录下一个5 min内小鼠的自发活动次数。

行为学实验结束后立即摘眼球取血，取室内静置2 h的全血置于离心机内，3 000 r/min离心15 min，取血清，−80 ℃储存待测。ELISA测定血清皮质酮的量，按照试剂盒的操作步骤进行，酶标仪上以（450±10）nm为测定波长，测定A值。

行为学实验结束后小鼠脱臼处死，冰砂上操作，取小鼠大脑，分离海马组织，称质量，于液氮中保存备用。测定前将海马组织用PBS溶液制备成10%匀浆液（1 g组织加入10 mL PBS），然后置于−20 ℃过夜。经反复冻融2次处理后，匀浆液于4 ℃、5 000 r/min离心5 min，取上清液，通过ELISA试剂盒测定NE、DA和5-HT的量。按照试剂盒的操作步骤进行，酶标仪上测定吸光度（A）值。

数据均以表示，用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析。

小鼠在明暗箱中的活动情况由视频监控录像记录，统计结果见表 1。与对照组相比，地西泮组能显著增加小鼠在明箱停留时间和穿箱次数（P＜0.05），蜘蛛香提取物中剂量组与总缬草素中剂量组均能显著增加小鼠在明暗箱中的穿箱次数（P＜0.05），蜘蛛香提取物与总缬草素其余各剂量组也能增加小鼠在明箱停留时间和穿箱次数，但与对照组比较差异不显著（P＞0.05）。

表 1 (Table 1)

表 1 蜘蛛香提取物与总缬草素对小鼠明暗箱实验的影响(x±s,n = 10) Table 1 Effects of crude extract and valeportriates from Valerianae Rhizoma on light/dark transition testin mice (x±s,n = 10) 组别 剂量/ (mg∙kg−1) 明箱停留 时间/s 穿箱次数 对照 — 125.38±34.63 37.16±17.70 地西泮 2 166.17±48.65 78.25±35.06 蜘蛛香提取物 50 134.00±25.70 46.70±22.23 100 151.67±32.46 59.27±12.65 150 144.92±35.60 45.12± 9.84 蜘蛛香总缬草素 30 134.04±34.49 52.62±18.86 60 135.69±36.07 76.80±36.77 90 142.39±41.13 50.45±19.32 与对照组比较：P＜0.05，表 2和3同 P < 0.05 vs control group,Tables 2 and 3 are same

表 1 蜘蛛香提取物与总缬草素对小鼠明暗箱实验的影响(x±s,n = 10) Table 1 Effects of crude extract and valeportriates from Valerianae Rhizoma on light/dark transition testin mice (x±s,n = 10)

结果见表 2。与对照组相比，地西泮能够显著增加小鼠在中央区停留的时间（P＜0.05），蜘蛛香提取物中剂量组和总缬草素中剂量组也能够显著增加小鼠在中央区的停留时间（P＜0.05）。其余各组均有增加小鼠在中央区的停留时间的趋势，但与对照组相比，差异不显著（P＞0.05）。

表 2 (Table 2)

表 2 蜘蛛香提取物与总缬草素对小鼠敞箱实验的影响 (x±s,n = 10) Table 2 Effects of crude extract and valeportriates from Valerianae Rhizoma on open field test in mice (x±s,n = 10) 组别 剂量/(mg∙kg−1) 中央区停留时间/s 对照 — 19.21± 8.74 地西泮 2 39.04±24.90 蜘蛛香提取物 50 31.40±19.69 100 36.86±23.18 150 33.32±20.13 蜘蛛香总缬草素 30 30.29±18.70 60 37.62±10.62 90 34.02±23.64

表 2 蜘蛛香提取物与总缬草素对小鼠敞箱实验的影响 (x±s,n = 10) Table 2 Effects of crude extract and valeportriates from Valerianae Rhizoma on open field test in mice (x±s,n = 10)

结果见表 3。与对照组相比，地西泮能够显著增加小鼠进入开臂次数的占比和开臂停留时间占比（P＜0.05），蜘蛛香提取物与总缬

表 3 (Table 3)

表 3 蜘蛛香提取物与总缬草素对小鼠高架十字迷宫实验的影响 (x±s,n = 10) Table 3 Effects of crude extract and valeportriates from Valerianae Rhizoma on evevated plus maze test in mice (x±s,n = 10) 组别 剂量/ (mg∙kg−1) 开臂进入次数 占比/% 开臂停留时间 占比/% 对照 — 34.99± 9.42 2.98±1.46 地西泮 2 47.17± 9.67 7.57±3.25 蜘蛛香提取物 50 43.87±16.29 4.86±2.84 100 43.13±14.44 4.96±3.52 150 44.09±18.74 4.61±3.16 蜘蛛香总缬草素 30 40.62±18.79 2.50±2.50 60 40.44±10.70 3.89±3.17 90 44.45±10.95 3.56±2.53

表 3 蜘蛛香提取物与总缬草素对小鼠高架十字迷宫实验的影响 (x±s,n = 10) Table 3 Effects of crude extract and valeportriates from Valerianae Rhizoma on evevated plus maze test in mice (x±s,n = 10)

草素各剂量组有增加小鼠进入开臂次数占比和开臂停留时间占比的作用趋势。

结果见表 4。地西泮组能够明显减少小鼠的自发性活动次数，与对照组相比，差异显著（P＜0.01）。蜘蛛香提取物与总缬草素各剂量组也能够显著减少小鼠的自发性活动次数，与对照组相比，差异显著（P＜0.01、0.001）。

表 4 (Table 4)

表 4 蜘蛛香提取物与总缬草素对小鼠自发性活动实验的影响 (x±s,n = 10) Table 4 Effects of crude extract and valeportriates from Valerianae Rhizoma on spontaneous activity test in mice (x±s,n = 10) 组别 剂量/(mg∙kg−1) 活动次数 对照 — 47.50±13.15 地西泮 2 32.00±12.13** 蜘蛛香提取物 50 30.10±14.32** 100 33.00± 7.38** 150 30.10± 8.85** 蜘蛛香总缬草素 30 23.91± 5.66*** 60 31.60±11.07** 90 24.40± 7.12*** 与对照组比较：**P＜0.01 ***P＜0.001 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs control group

表 4 蜘蛛香提取物与总缬草素对小鼠自发性活动实验的影响 (x±s,n = 10) Table 4 Effects of crude extract and valeportriates from Valerianae Rhizoma on spontaneous activity test in mice (x±s,n = 10)

表 5结果表明，与对照组相比，地西泮组和蜘蛛香提取物中剂量组能够显著降低小鼠血清皮质酮水平和脑海马组织中NE、DA、5-HT的量（P＜0.05、0.01、0.001）；蜘蛛香提取物低剂量组能够显著降低小鼠脑海马组织中DA和5-HT的量（P＜0.05）；蜘蛛香提取物高剂量组显著降低小鼠脑海马组织中NE的量（P＜0.05）。与对照组相比，总缬草素低剂量组可以显著降低小鼠脑海马组织中NE、DA的量（P＜0.05）；总缬草素中剂量组能显著降低小鼠血清皮质酮水平和小鼠脑海马组织中DA、5-HT的量（P＜0.05）；总缬草素高剂量组能显著降低小鼠血清皮质酮水平（P＜0.05）。

表 5 (Table 5)

表 5 蜘蛛香提取物与总缬草素对小鼠血清皮质酮及脑海马组织NE、DA、5-HT水平的影响 (x±s,n = 10) Table 5 Effectsof crude extract and valeportriates from Valerianae Rhizoma on levels of corticosterone in serum and NE,DA,and 5-HT in hippocampus of mice (x±s,n = 10) 组别 剂量/(mg∙kg−1) 皮质酮/(μg∙mL−1) NE/(pg∙mL−1) DA/(pg∙mL−1) 5-HT/(ng∙mL−1) 对照 — 16.05±3.88 31.71±10.10 1 511.81±501.54 29.56±10.87 地西泮 2 11.07±3.34 19.29± 6.91** 859.33±164.63*** 16.25± 4.63** 蜘蛛香提取物 50 11.81±5.63 23.68± 9.66 1 019.90±339.29 18.18± 6.54 100 11.02±4.58 20.20± 8.33 1 027.68±190.47 16.00± 4.12** 150 13.18±5.83 20.23± 5.99 1 174.06±312.34 22.02± 8.40 蜘蛛香总缬草素 30 12.08±3.43 21.18± 7.26 872.52±221.18 21.78± 9.79 60 10.91±5.41 23.29± 4.94 1 042.67±314.45 22.44± 6.07 90 11.10±4.14 25.08±10.46 1 467.84±265.25 23.06± 9.10 与对照组比较：P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs control group

表 5 蜘蛛香提取物与总缬草素对小鼠血清皮质酮及脑海马组织NE、DA、5-HT水平的影响 (x±s,n = 10) Table 5 Effectsof crude extract and valeportriates from Valerianae Rhizoma on levels of corticosterone in serum and NE,DA,and 5-HT in hippocampus of mice (x±s,n = 10)

传统的抗焦虑实验模型有高架十字迷宫、明暗箱、敞箱、饮水冲突实验、自主活动实验、孔板实验、包埋实验和小鼠期待性焦虑实验等^[8]，本研究选取经典明暗箱、敞箱、高架十字迷宫和自主活动4种模型^{[7, 8, 9, 10]}进行蜘蛛香提取物及蜘蛛香总缬草素的抗焦虑作用研究。所选实验模型均是利用新异环境的光线等原因造成焦虑刺激的行为，由于这些模型引起的焦虑状态可以使动物不需要特殊的训练，就可使动物处于类似于人类焦虑的生理状态，故这些模型方法快速简便，被常用来评价药物的抗焦虑作用。地西泮为目前临床应用最为广泛的抗焦虑药，具有选择性高、起效快、副作用相对较少等特点，本实验选取地西泮为阳性对照药物。在进行动物行为学实验时间的选择上，考虑到实验小鼠的生活习性，在8︰00～12︰00小鼠常处于活动较少的时间段，故本实验选择小鼠活动较为频繁的时间段15︰00～23︰00进行行为学实验，避免因为小鼠本身生活习性的影响而使实验小鼠的活动次数减少。为再次尽可能避免实验时间对行为学实验的影响，实验过程中采取对每个剂量组随机交叉轮流测试的方法进行行为学测试。

在明暗箱实验中，蜘蛛香提取物中剂量组与总缬草素中剂量组可明显增加小鼠的穿箱次数，并且其余各剂量组也均有增加小鼠在明箱停留时间和穿箱次数的趋势。在敞箱实验中，蜘蛛香提取物中剂量组与总缬草素中剂量组可明显增加小鼠在中央区的停留时间。在高架十字迷宫实验中，地西泮能够显著增加小鼠进入开臂次数的百分比和在开臂停留时间百分比，但蜘蛛香提取物与总缬草素各剂量组均无显著性效果。在自发性活动实验中，蜘蛛香提取物与总缬草素各剂量组均能够显著减少小鼠的自发性活动次数，即对小鼠的中枢神经有抑制作用，可以抑制其自主活动，提示蜘蛛香提取物及总缬草素在发挥抗焦虑作用的同时也发挥了其明显的镇静催眠作用。4种行为学实验结果表明蜘蛛香提取物和总缬草素对正常小鼠的焦虑症状均有一定程度的改善，且中剂量效果显著。

本实验主要针对丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴系统和脑组织神经递质两方面进行蜘蛛香提取物及总缬草素抗焦虑作用机制的研究。实验结果显示蜘蛛香提取物和总缬草素能够降低小鼠血清皮质酮的量，并下调脑内海马组织中NE、DA和5-HT的水平。

本研究表明蜘蛛香提取物及总缬草素均有抗焦虑作用，且作用机制与HPA和神经递质有关，总缬草素可能为蜘蛛香抗焦虑作用的有效部位，但关于蜘蛛香具体作用物质基础及作用机制有待深入研究。