桑菊饮为吴鞠通所创，首载于《温病条辨》，由桑叶、菊花、杏仁、连翘、薄荷、苦桔梗、生甘草、芦根8味中药组成，具有辛凉解表、疏风清热、宣肺止咳之功效。传统用于风温初起所致的咳嗽、口微渴、身热不甚、脉浮数等表热轻证^[1]，西医学急性上呼吸道感染、急性支气管炎等疾病均属本方应用范畴^[2]。本方在现代临床呼吸系统等疾病中应用广泛，诸多方剂均由本方加减而成。现代药理研究表明，桑菊饮对免疫系统有较好的调节作用，具有抗炎、止咳、祛痰、平喘、抑菌等诸多药理活性^[3]。

炎症在急性上呼吸道感染、急性支气管炎中起着关键性的作用。发病过程中炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素- 6（IL-6）及白细胞介素-8（IL-8）均在患者体内显著性升高^{[4, 5]}。核因子-κB（NF-κB）作为多种炎症介质表达所必需的转录调节因子，在调节免疫、炎症反应具有非常关键的作用^{[6, 7, 8]}。NF-κB转录因子调节着大量基因的表达，例如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8等细胞因子的表达均受其调节^[9]。

根据文献记载，桑菊饮中8味中药均具有较好的抗炎活性。Han等^[10]通过建立小鼠肺部急性感染模型，表明菊花给药后能显著降低TNF-α、IL-6和IL-8等炎症因子的表达。目前临床报道芦根可以用来治疗感冒、急慢性支气管炎等呼吸系统疾病。毛伟松^[11]采用芦根贝母汤加减治疗急性支气管炎，取得较好的治疗效果；陈福君等^[12]通过巴豆油所致小鼠耳廓肿胀实验，表明桑叶具有较强的抗炎作用；周幼龙^[13]采用薄荷大黄汤治疗急性扁桃体炎有较好的疗效；杏仁具有驱风的功效，传统上用于治疗胃炎、皮炎等疾病^[14]；甘草中的成分甘草酸，桔梗中的成分桔梗皂苷D^[15]，连翘中的连翘酯苷A^[16]可以通过抑制NF-κB的表达调控炎症因子的分泌。诸药合用组成的桑菊饮也具有较好的抗炎活性^[3]，但其作为复方联合应用的抗炎物质基础研究未见报道。如能明确其物质基础，对于科学阐释中药配伍理论，进一步探讨中医治法均有重要意义。

为了快速准确地筛选出桑菊饮中抗炎活性成分，本实验使用超高效液相色谱-四级杆/飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF）结合荧光素酶报告基因检测系统筛选抑制NF-κB活性成分的方法，从抗炎角度明确桑菊饮药效物质基础，筛选出16种具有NF-κB抑制活性的成分，其中胡萝卜酸、22β-乙酰基-甘草酸、甘草皂苷G2抑制NF-κB活性为首次报道。

桑叶、菊花、杏仁、连翘、薄荷、桔梗、甘草、芦根购自河北安国中药材批发市场，经天津药物研究院张铁军研究员鉴定为桑Morus alba L. 的干燥叶、菊花Chrysanthemum morifolium Ramat. 的干燥头状花序、杏仁Prunus armeniaca L. 的干燥成熟种子、连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl的干燥果实、薄荷Mentha haplocalyx Brip的干燥地上部分、桔梗Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC. 的干燥根、甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根、芦苇Phragmites communis Trin. 的干燥根茎。

桑菊饮提取物的制备：根据《温病条辨》记载，将桑叶（7.5 g）、菊花（3 g）、杏仁（6 g）、连翘（5 g）、薄荷（2.5 g）、桔梗（6 g）、甘草（2.5 g）、芦根（6 g），加水2 L，煮取1.3 L，真空泵滤过，浓缩，旋蒸得浸膏，称得浸膏质量为8.372 7 g，至于4 ℃冰箱中保存。

胰蛋白酶（Gibco，美国）；TNF-a（Peprotech，美国）；地塞米松（Dex，Sigma，美国）；PGL4.32质粒和内参质粒Prl-TK（Promega，美国）；细胞裂解液（Promega，美国）；双荧光酶报告基因试剂盒（Promega，美国）；脂质体2000转染试剂（PEI，Invitrogen，美国）；酶联免疫ELISA试剂盒（上海西唐生物科技公司）。

色谱纯甲醇、乙腈（Fisher，美国）；色谱纯甲酸（Acros，比利时）；亮氨酸-脑啡肽醋酸盐（Sigma- Aldrich，美国）；超纯水由Milli-Q制备（Millipore Laboratory，Bedford，美国）。

对照品咖啡酸（批号ABO97C，质量分数99.5%）、绿原酸（批号AZ001C，质量分数98.46%）、甘草酸（批号AB291G，质量分数98%）、马钱子苷（批号200604，质量分数98%）购于天津一方科技公司，胡萝卜酸（批号M813040，质量分数99.5%）购于上海麦恪林公司（中国）。

人胚肾上皮细胞293（HEK 293）、人支气管上皮细胞（BEAS-2B）购于美国Type Culture Collection，Rockville，MD公司。HEK 293培养于DMEM高糖培养基（HyClone，美国），包含10%牛血清白蛋白（FBS，Gibco，美国）和1%双抗（100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素 ，Gibco，美国）；BEAS-2B培养于10% FBS和1%双抗的RPMI 1640完全培养基，均在5% CO₂、37 ℃培养箱中培养。

Waters Acquity UPLC-Q/TOF Premier：配置自动进样器、柱温箱、PDA检测器、Masslynx 4.1工作站（Waters，美国）；色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；Velocity 14R高速冷冻离心机（Dynamic，澳大利亚）；Milli-Q超纯水仪（MILLIPORE，美国）；DZF-6020真空干燥箱（河南予化仪器有限公司）；HF151UV CO₂细胞培养箱（上海Heal Force公司）；XD-101倒置显微镜（南京东海光电子股份有限公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；AB104-N电子天平（Mettler Toledo公司）；BIOELLEA Reader ELX800（Bio-Tek，美国）；Modulus荧光检测仪（美国Turner Designs公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）。

HEK293细胞于96孔板中培养，待细胞汇合度在50%～70%时与NF-κB荧光素酶报告PGL4.32（100 ng/孔）及内参质粒Renilla（9.6 ng/孔）共转染，转染时使用脂质体2000作为辅助转染试剂。将适当比例的质粒和转染试剂置于无FBS的培养基中，混匀后静置15 min，以确保质粒与转染试剂充分结合。最后将转染液加入预培养的细胞96孔板中，于CO₂培养箱中共孵育24 h以上。

细胞实验分为6组，分别为空白组，模型组，阳性药地塞米松组，桑菊饮高、中、低剂量（1、0.1、0.01 mg/mL）组。细胞各组预给药6 h，阳性药组给予1×10⁻⁵ mol/L的地塞米松；空白组、模型组给予新鲜培养基，加入TNF-α（终质量浓度为10 ng/mL）造模6 h，收集的裂解液用于NF-κB荧光检验。

给药完成后，弃去细胞培养液，用PBS（100 μL/孔）洗涤细胞2次，弃去PBS液，加入配制好的细胞裂解液（20 μL/孔），室温振荡30 min后，每孔吸出15 μL细胞裂解液用于NF-κB双荧光素酶报告基因活性检测。

向15 μL细胞裂解液中加入20 μL NF-κB荧光素酶报告基因质粒pGL4.32（100 ng/孔）检测试剂，轻轻混匀后，检测NF-κB荧光值（Modulus荧光检测仪），再加入20 μL内参荧光素酶检测试剂，轻轻混匀后，检测Renilla荧光值。按公式计算NF-κB荧光素酶活性，以相对荧光比率表示NF-κB抑制率。

相对荧光比率＝NF-κB荧光值/Renilla荧光值

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温30 ℃；体积流量0.4 mL/min；PDA检测190～400 nm扫描；进样量2.0 μL；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；二元梯度洗脱条件：0～2 min，2% A；2～20 min，2%～20% A；20～40 min，20%～40% A；40～44 min，40%～85% A；44～45 min，85%～2% A。

使用正、负离子2种模式扫描测定，仪器参数如下：电喷雾离子源（ESI）；V模式；毛细管电压3.0 kV（正模式），2.5 kV（负模式）；锥孔电压30 V；离子源温度100 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂氮气流量600 L/h；锥孔气流量50 L/h；检测器电压1 900 V；采样频率0.1 s；间隔0.02 s；质量数扫描范围100～1 500；内参校正液Lockmass采用亮氨酸脑啡肽盐LEA（[M＋H]⁺＝ 555.293 1；[M－H]⁻＝553.277 5）。数据采集工作站为Masslynx 4.1。

精密称取桑菊饮浸膏10 mg，加入1 mL纯净水，配制成10 mg/mL水溶液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min离心15 min后取上清液，用于UPLC的馏份收集实验。样品经UPLC分离后，将流出液按每1分钟一段收集于96深孔板（规格：2.2 mL/孔）中，50 ℃真空干燥，挥去溶剂，再向每孔加入100 μL细胞培养基复溶，放于振荡器中振荡20 min，待物质完全溶解后，加入到预先转染好的细胞中分析每段馏份对NF-κB表达的影响。

通过分析Q-TOF提供的一级、二级质谱信息并结合文献的方法鉴定具有抗炎活性的化合物。经正、负模式下的一级质谱分析，得到化合物的准分子离子峰信息。通过精确质量数推断化合物的相对分子质量和元素组成。通过二级碎片信息，推断化合物的裂解规律，通过查阅大量文献以及数据库搜索，如chemspider，将裂解信息与文献或数据库中数据库进行比对，再参考化合物的紫外吸收和相对保留时间等信息，确定相关活性化合物的结构信息。

采用SPSS13.0软件进行数据统计，实验结果以x表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。

将咖啡酸、绿原酸、甘草酸、马钱子苷对照品用HEK293细胞培基稀释成1×10⁻⁴、1×10⁻⁵、1×10⁻⁶ mol/L进行细胞验证。操作方法同“2.1”项。

将BEAS-2B细胞培养于96孔板中24 h，完全贴壁后，细胞各组（将咖啡酸、绿原酸、甘草酸、马钱子苷和胡萝卜酸对照品用细胞培基稀释成1×10⁻⁴、1×10⁻⁵、1×10⁻⁶ mol/L进行细胞验证）预给药6 h后，用TNF-α（终质量浓度为10 ng/mL）刺激6 h后收集上清，测定IL-6、IL-8水平。

由图 1可见，TNF-α刺激后，模型组NF-κB的表达与对照组比较显著升高（P＜0.001），而与模型组相比，阳性药组NF-κB的表达明显降低（P＜0.01）。桑菊饮各剂量组均可降低NF-κB表达，且具有剂量依赖性。

图 1

Fig. 1

与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：P＜0.05 **P＜0.01 ###P< 0.001 vs control group; P < 0.05 **P < 0.01 vs model group 图 1 桑菊饮对NF-κB的抑制作用 (x±s,n = 3) Fig. 1 Inhibition of Sang Ju Yin on NF-κB levels (x±s,n = 3)

本实验通过UPLC/Q-TOF-MS的方法得到了桑菊饮的离子流图，紫外图及正、负离子流图分别见图 2-A～C。对桑菊饮45段馏份进行细胞活性筛选分析，发现其中16种样品（其中9号峰由2个化合物组成）具有抑制NF-κB活性（图 2-D）。

图 2

Fig. 2

A-紫外图 B-负离子模式离子流图 C-正离子模式离子流图 D-NF-κB抑制率活性图，黑色柱为有效馏份，上面的数字所对应的化合物的信息见表 1 A-UV chromatogram B-BPI chromatogram in negative mode C-BPI chromatogram in positive mode D-bioactivity chromatogram of inhibitory rate on NF-κB,Black columns represent active ingredients,the peak numbers are consistent with those in Table 1 图 2 UPLC-Q/TOF结合荧光素酶报告基因检测系统筛选桑菊饮中抑制NF-κB活性的单体成分 (x±s,n = 5) Fig. 2 Screening on inhibitory activity of NF-κB in Sang Ju Yin using UPLC-Q/TOF coupled with luciferase reporter assay system (x±s,n = 5)

按照“2.2.4”项方法对细胞实验筛选出的16种样品中包含的对NF-κB具有显著抑制活性成分进行结构鉴定。鉴定结果见表 1，结构见图 3。经质谱信息分析，文献检索及相关书籍《中药原植物化学成分集》等的查阅，得到这16种化合物，6个来源于甘草，4个来源于连翘，5个来源于菊花，1个来源于桔梗。

表 1 (Table 1)

表 1 桑菊饮样品中抗炎活性成分结构信息 Table 1 Information of bioactive compounds with anti-inflammation in SangJu Yin 峰号 tR/min 活性成分 离子模式 m/z MS/MS 化学式 来源 1 4.02 胡萝卜酸 负 204.027 0 203 [M－H]−,185 [M－H2O－H]−, 249 [M＋HCOOH－H]− C7H8O7 菊花 2 6.93 绿原酸 负 354.095 1 353 [M－H]−,191 [M－caffeoyl－H]−, 399 [M＋HCOOH－H]− C16H18O9 菊花 3 16.09 甘草苷 负 418.126 4 417 [M－H]−,255 [M－Glu－H]−, 835 [2M－H]− C21H22O9 甘草 4 17.02 甘草苷元-4′-芹糖葡萄糖苷 负 550.168 6 549 [M－H]−,595 [M＋HCOOH－H]−,1 099 [2M－H]− C26H30O13 甘草 5 19.01 连翘脂苷A 负 624.205 4 623 [M－H]−,461 [M－Glu－H]−, 1 247 [2M－H]− C29H36O15 连翘 6 19.07 甘草次酸 正 470.339 6 471 [M＋H]+,325 [M－rhamnose＋H]+,163 [M－rhamnose－Glu＋H]+ C15H16O8 甘草 7 19.46 异连翘脂苷A 负 624.205 4 623 [M－H]−,461 [M－Glu－H]−, 124 7 [2M－H]− C29H36O15 连翘 8 19.48 连翘脂苷D 正 478.168 6 479 [M＋H]+,642 [M＋rhamnose]+,643 [M＋rhamnose＋H]+ C20H30O13 连翘 9 20.04 (+)-松脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷＋ 3,5-二咖啡酰基奎宁酸 负 520.194 5 516.126 8 519 [M－H]−,357 [M－Glu－H]−, 565 [M＋HCOOH－H]−； 515 [M－H]−,353 [M－caffeoyl－H]−, 191 [M－2caffeoyl－H]− C19H35O16 C25H24O12 连翘＋ 菊花 10 20.01 L-苯基丙酸氨基断马钱子苷 正 537.221 0 538 [M＋H]+,357 [M－Glu＋H2O]+, 555 [M＋H2O]+ C26H35NO11 菊花 11 32.63 刺槐素-7-O-6″-甲基葡萄糖苷 正 532.121 3 533 [M＋H]+,550 [M＋H2O]+, 285 [M＋H－malonylgalactoside]+ C25H24O13 菊花 12 32.87 桔梗皂苷D 正 1 224.577 5 1 225 [M＋H]+,1 242 [M＋H2O]+, 1 063 [M－Glu＋H]+ C57H92O28 桔梗 13 35.11 22β-乙酰基-甘草酸 负 880.409 3 879 [M－H]−,923 [M＋HCOOH－2H]−,938 [M＋CH3COOH－2H]− C44H64O18 甘草 14 38.00 甘草皂苷G2 正 838.398 7 839 [M＋H]+,857 [M＋H2O＋H]+, 469 [M－2glucuronic acid]+ C42H62O17 甘草 15 40.23 甘草酸 正 822.403 8 823 [M＋H]+,841 [M＋H2O＋H]+, 453 [M－2glucuronic acid]+ C42H62O16 甘草

表 1 桑菊饮样品中抗炎活性成分结构信息 Table 1 Information of bioactive compounds with anti-inflammation in SangJu Yin

图 3

Fig. 3

图 3 桑菊饮中活性单体的化学结构 Fig. 3 Chemical structures of active monomers in Sang Ju Yin

选取咖啡酸、绿原酸、甘草酸、马钱子苷、胡萝卜酸按“2.3.1”项方法进行细胞验证。咖啡酸、绿原酸、甘草酸、马钱子苷等成分在浓度1×10⁻⁵ mol/L时抗炎活性较好已有报道^[17]，实验设计中把1×10⁻⁵ mol/L作为阳性验证的浓度，来说明双荧光素酶报告系统可以成功地进行植物提取液NF-κB的筛选。并且由于活性成分22β-乙酰基-甘草酸、甘草皂苷G2、胡萝卜酸为首次报道，故在实验中做了胡萝卜酸的梯度验证，发现胡萝卜酸（1×10⁻⁵ mol/L）能够抑制NF-κB的表达。由图 4可见，5个化合物咖啡酸、绿原酸、甘草酸、马钱子苷、胡萝卜酸也可以降低细胞炎症因子IL-6和IL-8的表达水平（P＜0.05、0.01、0.001）。

图 4

Fig. 4

与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 ###P < 0.001 vs control group; P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs model group 图 4 桑菊饮整方及活性成分单体验证 (A和B：双荧光素酶报告系统验证活性单体NF-κB的抑制量；C和D：活性单体及桑菊饮整方降低细胞炎症因子IL-6和IL-8的表达量,x±s,n = 3) Fig. 4 Confirmation of bioactive compounds from holistic Sang Ju Yin and active monomers(A and B: inhibition of NF-κB verified by luciferase reporter assay; C and D: IL-6 and IL-8 expression in TNF-α reduced by holistic Sang Ju Yin,x±s,n = 3)

因为具有低毒、高效的特点，传统中药越来越受到人们的重视，而复方制剂因为多种成分的配伍使用，常常发挥比单味饮片更佳的治疗效果，如文献中记载复方黄连解毒汤，其主要成分包括黄酮和生物碱等，这些主、次成分彼此协同，从而达到比较好的抗炎效果^[18]。但同时中药具有成分复杂，质量可控性差等缺点。简单选取几种药效成分并不能对中药进行有效质量控制。如《中国药典》在菊花的质量控制中，只选取绿原酸，木犀草苷和异绿原酸A为指标成分，但这并不能满足菊花药材质量控制需求^[10]。另一方面阐明桑菊饮的抗炎物质基础，不但能为其建立可靠质量标准提供依据，还有助于下一步了解桑菊饮的抗炎机制，明确药物作用的靶点，而为后续精简复方，去除有害成分，找到具有较少的副作用，更好疗效的抗炎药物做准备。

本实验采用UPLC/Q-TOF结合NF-κB双荧光素酶报告基因系统，筛选出桑菊饮中15段共16种活性成分。其中5个活性成分来源于菊花，6个来源于甘草，4个来源于连翘，1个来源于桔梗。绿原酸、甘草酸、桔梗皂苷D、咖啡酸、马钱子苷、连翘脂苷A、甘草苷等成分抗炎活性已有报道^{[19, 20, 21]}，胡萝卜酸、22β-乙酰基-甘草酸、甘草皂苷G2等调控NF-κB活性为首次报道。

上皮细胞是气道与外界的屏障，是细菌感染的直接接触部位，更是炎症反应和药物作用的主要位点，在细胞因子及各种免疫调节介质的产生过程中起着十分重要的作用。在本研究中，首先选用人支气管上皮细胞建立炎症模型，在体外细胞水平上评价筛选出的5个单体，即咖啡酸、绿原酸、甘草酸、马钱子苷和胡萝卜酸，实验结果显示这5个化合物都能够明显抑制NF-κB的表达，也可以降低细胞炎症因子IL-6和IL-8的表达水平，与筛选结果相一致。

通过本实验筛选出桑菊饮中比较好的抗炎活性成分，初步明确了其抗炎物质基础，为进一步阐明其抗炎作用机制提供了条件，也为以后建立其质量标准提供依据。但由于桑菊饮中化学成分复杂，本实验筛选出的一些比较好的活性峰并不是单一成分，如图 2-D中第5个活性柱，经鉴定有效成分有5、6；第6个活性柱，有效成分有7、8、9、10；第7个活性柱，有效成分有11、12。并且对于复方中的主、次成分是否存在协同抗炎及这些成分与桑菊饮其他药理活性，比如抗菌、解热、发汗、抑制肠蠕动亢进和增强免疫是否存在联系也需要进一步的研究^[3]。