肺癌为临床常见肿瘤，也是引起肿瘤患者死亡的常见原因。肺癌患者在确诊时很多已属晚期，能手术的病例较少，往往以放疗及化疗为主，预后较差，约80%病人在诊断后1年内死亡^[1]，中晚期肺癌的治疗目前主张多方法综合治疗。中西医结合及中医药治疗肺癌，已显示其在减少毒副反应、改善症状、稳定病灶、提高生存质量、延长生存期和提高生存率等方面优势^[2]。目前，中医对肺癌病因病机的认识有“正气虚损学说”“邪毒侵肺论”“痰湿内聚论”3种学说。临床采用扶正培本和清热解毒，软坚化痰，活血化瘀酌情伍用治法，取得了较好的疗效^[2]。

在众多治疗肺癌的复方中，猪苓为常用药物^{[3, 4]}。猪苓多糖(polyporus polysaccharide，PPS)为猪苓的主要成分，现代药理研究表明，PPS具有增强免疫、抗肿瘤等多种功能^[5]，体内外实验均表明，PPS对肺癌细胞有抑制作用^[6]，但其作用机制尚不清楚。本实验拟观察PPS对肺癌A549细胞增殖的作用，并初步探讨其相关的分子生物学机制。

肺癌A549细胞株购自中山大学生物细胞库。

PPS购自南京泽朗生物科技有限公司，质量分数为95%，批号为ZL2015050651。胎牛血清、RPMI 1640培养基、0.25%胰酶-EDTA消化液均购自美国Gibco公司；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒、逆转录试剂盒、蛋白酶抑制剂、RIPA缓冲液均购自德国Roche公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司，兔抗人Cyclin D1抗体、兔抗人人抗原R(HuR)抗体、兔抗人β-actin抗体、兔抗人α-tubulin抗体、Lanin B1抗体、HRP标记抗兔抗体均购自美国CST公司；Western blotting所用试剂购自美国Bio-Rad公司。

酶标仪，美国Perkin Elmer公司；FC500流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司；电泳及转印系统、凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；7500实时荧光定量基因扩增系统，美国ABI公司。

A549细胞常规培养在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，置37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。实验分4组，对照组(正常培养的细胞，未做任何处理)和PPS低、中、高剂量(50、100、200 μg/mL)组。

取对数生长期A549细胞，用培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度为3×10⁴/mL，接种于96孔，每孔100 μL，培养24 h后，各实验组加入相应量的药物和培养基至每孔液体总量为20 μL，实验设6个复孔，继续培养24、48、72 h后，各孔分别加入MTT(5 mg/mL)20 μL，继续培养4 h，弃培养上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，震荡待结晶溶解后酶标仪上检测490 nm波长下的吸光度(A)值。

各组细胞常规培养48 h后，收集细胞到离心管中离心，应用预冷的PBS洗涤收集的细胞3次，离心沉淀细胞，弃上清。以70%预冷的乙醇重悬细胞，吹打均匀，4 ℃储存过夜；离心乙醇固定过的细胞，弃上清，PBS洗涤细胞3次以去除残留的乙醇。应用细胞周期检测试剂重悬细胞，常温避光染色30 min，应用流式细胞仪测定细胞周期。计算增殖指数。

增殖指数＝(G₂/M＋S)/(G₀/G₁＋S＋G₂/M)

A549细胞接种于6孔板，常规培养后于对数生长期分别加入不同质量浓度(50、100、200 μg/mL)的PPS培养48 h；收集细胞后用RIPA提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，100 ℃变性8 min，SDS-PAGE蛋白电泳，后将蛋白转至PVDF膜，室温封闭1 h后用一抗4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次，二抗室温孵育1 h，洗涤后以ECL化学发光法于凝胶成像系统进行检测。

细胞分组及培养方法同“2.4”项；用Trizol抽提细胞总RNA，按Roch试剂盒操作说明逆转录cDNA。Cyclin D1上游引物：5’-GGGCAGCAGAA- GCGAGAG-3’，下游引物：5’-GTTCCTCGCAG- ACCTCCAG-3’。以β-actin为内参，其上游引物：5’-GTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3’，下游引物：5’-TCACAATGTGGCCGAGGACTTT-3’。qRT-PCR扩增条件为：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，循环40次；扩增完毕后进行熔解曲线分析。

细胞分组及培养方法同“2.4”项；将放线菌素D以DMSO溶解后，加入培养基内，使放线菌素D的终质量浓度为5 ng/mL，给予放线菌素D处理后的0、2、4、6 h时间点分别收集细胞，提取RNA，以qRT-PCR法检测Cyclin D1的mRNA的水平，设定各组细胞0 h mRNA的量为100%，计算各组细胞2、4、6 h各时间点相对该组0 h的mRNA量的比值，绘制各组Cyclin D1 mRNA的降解拟合曲线，比较各组细胞Cyclin D1 mRNA的稳定性^[5]。

各实验组细胞经不同质量浓度(50、100、200 μg/mL)PPS处理24 h后，弃去培养基，以预冷的PBS缓冲液清洗细胞2次。以细胞刮收集细胞至离心管，离心，弃上清，按胞核-胞浆蛋白提取试剂盒说明分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白。用Western blotting法检测总的、胞浆和胞核HuR的蛋白表达，具体操作方法同“2.4”项。

用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析；对于各组细胞Cyclin D1 mRNA稳定性比较，采用重复测量资料的方差分析。

A549细胞在不同质量浓度PPS分别作用24、48、72 h后，用MTT检测A549细胞的增殖，与对照组相比，50 μg/mL PPS组与对照组测得的A值在各个时间点上均没有显著差异(P＞0.05)，100、200 μg/mL PPS组在24、48、72 h各时间点均能明显抑制A549细胞的增殖(P＜0.05)。结果见图 1。

与对照组比较：*P＜0.05，下同 *P < 0.05 vs control group,same as below 图 1 PPS对A549细胞增殖的影响 (x±s,n = 6)Fig.1 Effect of PPS on proliferation of A549 cells (x±s,n = 6)

细胞在不同质量浓度PPS分别作用48 h后，流式细胞仪检测显示，中、高剂量PPS组A549细胞的增殖指数降低(P＜0.05)。结果见图 2。

图 2 PPS对A549细胞增殖指数的影响(x±s,n = 3)Fig.2 Effect of PPS on proliferation index of A549 cells(x±s,n = 3)

qRT-PCR检测显示，与对照组比较，不同质量浓度PPS作用于A549细胞48 h后，PPS低剂量组与对照组Cyclin D1 mRNA表达无显著差异，PPS中、高剂量组Cyclin D1 mRNA表达明显减少(P＜0.05)。结果见图 3。

图 3 PPS对A549细胞Cyclin D1 mRNA表达的影响(x±s,n = 3) Fig.3 Effect of PPS on expression of Cyclin D1 mRNA in A549 cells (x±s,n = 3)

Western blotting检测显示，与对照组比较，不同质量浓度PPS作用于A549细胞48 h后，PPS低剂量组与对照组Cyclin D1蛋白表达没有显著差异，PPS中、高剂量组Cyclin D1蛋白表达明显减少(P＜0.05)。结果见图 4。

图 4 PPS对A549细胞Cyclin D1蛋白表达的影响 (x±s,n = 3)Fig.4 Effect of PPS on expression of Cyclin D1 protein in A549 cells (x±s,n = 3)

分别于放线菌素D处理0、2、4、6 h检测Cyclin D1 mRNA的量，绘制衰减曲线，与对照组比较，PPS低剂量组与对照组Cyclin D1 mRNA稳定性没有明显差别，PPS中、高剂量组Cyclin D1 mRNA稳定性明显下降(P＜0.05)。

图 5 PPS对A549细胞Cyclin D1 mRNA稳定性的影响(x±s,n = 3) Fig.5 Effect of PPS on stability of Cyclin D1 mRNA in A549 cells (x±s,n = 3)

不同质量浓度PPS作用于A549细胞48 h后，各组细胞总HuR蛋白比较，差异不显著(P＞0.05)；与对照组比较，50 μg/mL PPS组胞浆HuR蛋白无明显变化，100、200 μg/mL PPS组胞浆HuR蛋白表达明显减少(P＜0.05)；与对照组比较，50 μg/mL PPS组胞核HuR蛋白无明显变化，100、200 μg/mL PPS组胞核HuR蛋白表达明显增加(P＜0.05)，见图 6。

图 6 PPS对A549细胞HuR蛋白亚细胞定位的影响 (x±s,n = 3)Fig.6 Effect of PPS on subcellular distribution of HuR protein in A549 cells (x±s,n = 3)

细胞增殖是由于细胞生长和细胞分裂而导致细胞数目的增加，真核细胞的细胞周期分为间期和分裂期，间期又分为G₁期、S期、G₂期。本实验通过MTT研究显示，PPS可抑制A549细胞的增殖；流式细胞周期分析也显示PPS可抑制A549细胞的增殖指数，中、高剂量PPS组细胞G₁期比例明显升高(P＜0.05)，而G₂期和S期细胞比例明显降低(P＜0.05)，增殖指数明显下降(P＜0.05)，提示PPS可抑制A549细胞G₁期向S期转换。

在真核细胞细胞周期的调控中，Cyclin D1是调控G₁期向S期转化的重要蛋白，能和细胞周期依赖激酶形成蛋白复合体，最终使细胞通过G₁/S控制点，进入DNA合成的S期。研究表明，Cyclin D1基因是一种原癌基因，在多种肿瘤中发现了Cyclin D1基因表达升高，包括肺癌、乳腺癌、膀胱癌、甲状旁腺癌等。本研究显示，中、高剂量的PPS可降低A549细胞Cyclin D1 mRNA的量，也可降低Cyclin D1蛋白的表达。因此推测PPS抑制A549细胞增殖的作用可能与其降低Cyclin D1蛋白的表达有关。

mRNA是蛋白质生物合成的模板，在真核生物基因表达的转录后水平调控中，mRNA稳定性起重要作用，其机制主要通过影响mRNA的降解速率影响蛋白质的翻译效率。放线菌素D是一种最常用的基因转录抑制剂^[6]，能嵌合于DNA双链内与鸟嘌呤基团结合，抑制DNA依赖的RNA聚合酶活力，干扰细胞的转录，从而抑制mRNA合成。放线菌素D抑制了DNA的转录为mRNA的过程，则mRNA的水平只与mRNA的降解速度有关，此时mRNA降解的速度可反映其稳定性。本实验研究表明，中、高剂量PPS组细胞的Cyclin D1 mRNA的稳定性较对照组细胞明显降低，与之相应的Cyclin D1 mRNA的水平及Cyclin D1蛋白表达量下降，推测PPS导致的Cyclin D1 mRNA的稳定性下降减少了用于翻译的mRNA的模板量，最终使Cyclin D1蛋白表达水平降低。

真核生物的RNA转录在细胞核内完成，而翻译合成蛋白质在胞质中完成，故合成的mRNA需要转运至胞质合成蛋白质，在此过程中，mRNA常受到核酸酶的破坏而降解。在此过程中，ARE(AU-rich element)结构很重要。ARE是位于mRNA 3’端非翻译区(3’-untranslated regions，3’-UTR)的一类十分重要的顺式调控元件，常见的有UUAUUUAUU和AUUUA重复序列2种形式^[7]。HuR是一个重要的RNA结合蛋白，与mRNA有高度亲和性，直接或间接结合ARE结构而调控mRNA的降解^{[8, 9, 10]}。HuR可在细胞核和细胞浆之间穿梭，静息状态下HuR多定位于核内，在细胞外信号作用下，胞浆中HuR蛋白量增高，并通过RNA识别基序(RRM)与多种mRNA 3’-UTR的ARE结合，使mRNA在由胞核转运至胞浆的过程中免受核酸酶降解，从而增加mRNA稳定性^{[11, 12, 13]}。Cyclin D1 mRNA的3’-UTR含有较多的ARE结构，目前已发现胞浆HuR可参与Cyclin D1 mRNA稳定性的调控^{[13, 14, 15]}。

本实验研究表明，PPS作用于A549细胞时，胞核内的HuR水平升高、胞浆内HuR水平降低，细胞内总的HuR蛋白没有明显变化，故PPS可以改变HuR在细胞内的定位。而胞浆HuR水平对Cyclin D1 mRNA稳定性起重要作用，本实验中，PPS作用后A549细胞胞浆HuR水平下降，Cyclin D1 mRNA的稳定性也下降，提示二者之间的相关性，即在PPS作用后，Cyclin D1 mRNA的稳定性下降可能是由于胞浆HuR水平的下降引起。而Cyclin D1 mRNA的稳定性下降最终导致Cyclin D1蛋白的表达量下降及细胞增殖的抑制。

综上所述，本研究结果证实PPS可以抑制A549细胞的增殖，此作用可能是因为PPS减少HuR在A549细胞胞浆内表达，降低Cyclin D1 mRNA的稳定性和Cyclin D1蛋白表达而引起。然而，mRNA的稳定性受到多种因素的调节，要想肯定PPS通过改变HuR在细胞内定位而降低Cyclin D1 mRNA的稳定性之间的相关性，还需要通过免疫共沉淀等方法确定其二者之间的关系，本课题组将继续深入研究。