肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理过程，以细胞外基质(ECM)成分的过度增生与异常沉积为特征。近年研究发现，肝脏血管新生是肝纤维化的重要病理特点^[1]，也是门脉高压发生、发展的病理机制^{[2, 3]}，更重要的是，血管新生是肝纤维化难以逆转的重要原因^[4]，其中肝窦内皮细胞是肝纤维化血管新生的关键细胞学基础。

丹参始载于《神农本草经》，具有活血散瘀、通经止痛、宁心安神等功效^[5]。现代药理学研究发现，丹参在治疗慢性肝病，尤其是抗肝纤维化方面有很好的疗效^[6]。同时研究也表明丹参对肿瘤及缺血性疾病的血管新生具有干预作用^[7]。丹参成分包括水溶性和脂溶性两大类，其中水溶性成分主要为酚酸类化合物，包括丹参素钠、丹酚酸A、丹酚酸C、迷迭香酸、咖啡酸、丹酚酸B等，研究证实丹参对急慢性肝损伤有治疗作用^[8]。本研究通过观察丹参水溶性成分对人肝窦内皮细胞增殖、转基因斑马鱼及鸡胚血管生成的影响，评价丹参水溶性成分抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性。

丹参素钠、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、咖啡酸、迷迭香酸，由上海融禾医药科技发展有限公司分离、提取、鉴定，质量分数＞98%；甲苯磺酸索拉非尼片(简称索拉菲尼，商品名多吉美)，购自Bayer公司，质量分数＞98%，批号PY595112。CCK-8检测试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司。

内皮细胞培养基、胎牛血清(FBS)、内皮细胞生长补充因子(ECGS)，购自Scinecell^TM公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司；CD31，购自Abcam公司；EdU细胞增殖试剂盒，购自广州锐博生物科技有限公司；NO荧光探针、NOS试剂盒，购自碧云天生物技术研究所。

人来源的肝窦状内皮细胞HHSEC细胞株，上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所长期保存，以含5% FBS的内皮细胞培养液培养，每3天传代1次。斑马鱼购自山东省科学院，鸡胚购自上海市农业科学院。

Olympus IX70倒置显微镜(日本Olympus)；Image-pro Plus 6.1图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)；ArrayScan® VTI 高内涵筛选分析仪(美国Thermo Scientific)；微孔板扫描分光光度计(美国Bio-Tek)；Thermo Scientific Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪(美国Thermo Scientific)。

按每孔7 500个HHSEC细胞接种于96孔板，长至亚单层，弃原培养液。6种丹参主要水溶性成分以含5% FBS的内皮细胞培养液稀释成5～160 μmol/L添加至HHSEC细胞，同时设正常培养液作为对照组，设4个复孔，孵育48 h。弃原培养液，添加CCK-8工作液，100 μL/孔，再孵育2 h，于波长450 nm处微孔板扫描分光光度计测定各孔吸光度(A)值。分别与对照组进行比较，以各药物组与对照组A值有显著差异(P＜0.05)的相应浓度为有毒浓度，从而确定各成分无毒浓度。丹酚酸A、丹酚酸C、丹参素钠、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B浓度分别在12.5、100、25、50、50、12.5 μmol/L以下时对HHSEC细胞活力无显著影响。

以每孔7 500个HHSEC细胞接种于96孔板，待细胞长至亚单层，在无毒浓度范围内，分别选择丹酚酸A 10 μmol/L、丹酚酸C 80 μmol/L、丹参素钠20 μmol/L、咖啡酸40 μmol/L、丹酚酸B 10 μmol/L、迷迭香酸40 μmol/L(各成分对细胞无毒浓度的0.8倍)及阳性对照索拉非尼5 μmol/L与2%ECGS共同孵育48 h诱导细胞增殖，以正常培养基为对照组，单独ECGS作用为模型组。按照“2.1.1”项方法测定各组A值。

细胞接种及分组给药同“2.1.2”项。细胞经药物处理48 h后，弃原培养液，加入50 μmol/L EdU溶液孵育2 h，4%多聚甲醛固定15 min，0.2%甘氨酸孵育10 min，PBS洗5 min×2次，0.5% Triton X-100透化10 min，PBS洗5 min，Appllo^®染色反应液避光孵育30 min，PBS洗5 min×3次，Hoechst避光孵育10 min，PBS洗5 min×2次，ArrayScan® VTI高内涵筛选分析仪检测各组细胞荧光强度。

(1)NO水平检测：细胞接种及分组给药同“2.1.2”项。细胞经药物处理48 h后，弃药物培养液，原位装载5 μmol/L DAF-FM DA(NO探针)，100 μL/孔，37 ℃培养箱内孵育20 min，PBS洗3次，Thermo Scientific Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪上检测各组细胞荧光强度，使用495 nm激发波长，515 nm发射波长。(2)NOS活性检测 细胞接种及分组给药同“2.1.2”项。细胞经药物处理48 h后，弃原培养液，加入100 μL NOS检测缓冲液，加入100 μL检测反应液，37 ℃细胞培养箱内孵育2 h，PBS洗3次，Thermo Scientific Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪上检测，使用495 nm激发波长，515 nm发射波长。

细胞接种及分组给药同“2.1.2”项，细胞经药物处理48 h后，弃原培养液，多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤2次，2.5%小牛血清白蛋白室温封闭1 h，一抗37 ℃孵育60 min，PBS洗涤3次，相应的荧光二抗37 ℃孵育1 h，DAPI染核5 min，PBS洗涤3次，高内涵分析^[9]。

种蛋大头朝上，无菌培养箱孵育72 h，温度37.8 ℃，湿度60%。眼科剪在种蛋大头打孔，10 mL无菌注射器吸取蛋清4～6 mL，弃去。在种蛋中间位置开口，加100 μmol/L的各药物成分(部分药物剂量高于100 μmol/L，出现鸡胚坏死，各成分浓度统一确定为100 μmol/L)100 μL，对照组加生理盐水，每组6个种蛋，透明胶带密封开窗处，继续孵育24 h，摄片，Image-pro plus 6.1图像分析软件分析血管面积。

转基因斑马鱼(VEGFR:GFP)受精卵发育24 h，移至96孔板中，每孔预加入受试样品溶液(多次实验摸索发现100 μmol/L药物浓度为斑马鱼可耐受浓度)，每组5个复孔，对照为胚胎培养用水加相应量的助溶剂，加盖封闭，置于光照培养箱(28 ℃)内继续发育24 h，于倒置显微镜下观察，记录节间血管(ISV)的血流情况。麻醉，荧光显微镜下对体节间血管进行计数并拍照。

计量资料以x±s表示，数据均使用SPSS 12.0软件进行统计学分析，组间比较使用单因素方差分析。

CCK-8法检测结果(图 1)显示，丹酚酸A(10 μmol/L)、丹酚酸C(80 μmol/L)、丹酚酸B(10 μmol/L)均能显著抑制ECGS刺激的HHSEC细胞活力；丹参素钠(20 μmol/L)、咖啡酸(40 μmol/L)、迷迭香酸(40 μmol/L)无明显抑制作用。

N-对照 M-模型 S-索拉非尼 SAAS-丹参素钠 SAA-丹酚酸A RA-迷迭香酸 SAC-丹酚酸C CA-咖啡酸 SAB-丹酚酸B，与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ## P＜0.01，下同 N-control M-model S-sorafenib SAAS-Salvianic acid A sodium SAA-salvianolic acid A RA-rosmarinic acid SAC-salvianolic acid C CA-caffeic acid SAB-salvianolic acid B,*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group,same as below 图 1 丹参水溶性成分对ECGS诱导的HHSEC细胞活力的影响(x±s, n = 4)Fig.1 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhizaon HHSEC cells activity induced by ECGS (x±s,n = 4)

EdU法检测细胞增殖显示，与对照组相比，模型组ECGS诱导的HHSEC细胞增殖明显；与模型组相比，索拉非尼、丹酚酸A、丹酚酸C、丹酚酸B可以明显抑制ECGS诱导的细胞增殖(图 2)。

图 2 丹参水溶性成分对ECGS诱导的HHSEC细胞增殖的影响(x±s,n = 4) Fig.2 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhiza on HHSEC cells proliferation induced by ECGS (x±s,n = 4)

与对照组相比，ECGS诱导的HHSEC细胞NO水平和NOS活性明显升高；与模型组相比，索拉非尼、丹酚酸C、丹酚酸B、丹酚酸A可显著降低细胞NO量及NOS活性，其余组无显著变化(图 3)。

图 3 丹参水溶性成分对HHSEC细胞内NO水平和NOS活性的影响 (x±s,n = 4) Fig.3 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhiza on intracellular NO level and NOS activity of HHSEC cells (x±s,n = 4)

与对照组相比，ECGS诱导的HHSEC细胞CD31表达明显升高；与模型组相比，索拉非尼、丹酚酸A、丹酚酸C、丹酚酸B组细胞内CD31表达显著降低，其余各药物组对CD31无明显影响(图 4)。

图 4 丹参水溶性成分对HHSEC细胞CD31表达的影响 (x±s,n = 4) Fig.4 Effectsof water-soluble components from S. miltiorrhiza on CD31 expression in HHSEC cells (x±s,n = 4)

实验结果显示，与对照组相比，索拉非尼、丹酚酸B、丹酚酸A、咖啡酸可显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管新生，其余各药物无明显作用(图 5)。

图 5 丹参水溶性成分对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响 (x±s,n = 6) Fig.5 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhiza on angiogenesis in chick chorioallantoic membranes (x±s,n = 6)

实验结果显示，与对照组相比，索拉非尼和丹酚酸C对斑马鱼功能血管具有明显的抑制作用，其余组无明显抑制作用(图 6)。

图 6 丹参水溶性成分对斑马鱼血管新生的影响 (x±s,n = 5) Fig.6 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhiza on angiogenesis of transgenic zebrafish (x±s,n = 5)

近年来，随着肝纤维化、肝硬化研究的不断深入，相关认识也发生很大变化。肝纤维化不仅存在严重程度、病理特点、分子病理机制的差异，而且存在静止性与活动性的区别。与静止性肝纤维化相比，活动性肝纤维化纤维间隔内有大量血管增生与炎性细胞浸润，这种血管新生特征明显的肝纤维化进展迅速，且难以逆转，即使纤维胶原成分被降解吸收，肝小叶结构亦难以恢复到正常状态，其危害更为严重^{[1, 10]}。

肝脏血管结构由肝窦内皮细胞(LSECs)和周细胞组成。LSECs构成血管腔，是血管或肝窦的基础。在炎性损伤等病理情况下，LSECs可发生“去分化”表型改变：失窗孔、CD31表达增加，回到原始幼稚状态；胞内NO水平可影响细胞表型发生改变^{[11, 12, 13]}，促进血管新生的发生与发展。研究结果显示，丹酚酸A、丹酚酸C、丹酚酸B能够抑制细胞增殖；降低胞内NO水平以及NOS活性；下调HHSEC细胞CD31表达。

鸡胚绒毛尿囊膜是高度血管化了的、附着于蛋壳内面、薄而透明的膜结构，无需特别准备便能观察到其微血管结构变化，是公认的测试促进或抑制血管新生药物的试验器官^[14]。斑马鱼血管以其直观性强、易于获得、重复性好且基因组与人类基因组具有高度同源性^[15]，逐渐被用作筛选血管活性药物的模型。故本研究采用这两个模型，从器官和整体水平评价药物抑制血管新生的活性。结果提示，丹酚酸A、咖啡酸、丹酚酸B对鸡胚绒毛尿囊膜血管具有抑制作用；丹酚酸C能够显著抑制斑马鱼功能血管数量。

本研究采用肝窦内皮细胞增殖模型、鸡胚绒毛尿囊膜实验及转基因斑马鱼模型，从细胞、器官、整体层次评价丹参水溶性成分抑制血管新生的活性，综合不同层次实验结果，初步发现丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C具有调节内皮细胞功能、抑制血管新生的良好效果，其作用机制仍有待于后期结合体内实验进一步研究