2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.06.010 |
2. 西南大学药学院, 重庆 400715;
3. 重庆市中药研究院, 重庆 400065
,
LI Wei1,
ZHANG Chuan-hui3,
WANG Yun-hong3,
JIANG Yao3,
CHEN Jiao1,
ZHAO Feng-ping1,
YANG Rong-ping1,2
2. College of Pharmacy, Southwest University, Chongqing 400715, China;
3. Chongqing Academy of Chinese Traditional Materia Medica, Chongqing 400065, China
白头翁汤出自明代皇甫中《明医指掌》(卷四)，由白头翁、黄连、秦皮3味药物组成，具有清热解毒、凉血止痢之功效，主治协热自利、小便赤涩[1]，临床疗效显著。白黄泄热止痢片复方是在白头翁汤的基础上加减清虚热药青蒿组合而成的经验方，不仅保留了原处方疗效，而且可治泄泻兼阴虚发热、夜热早凉或低热不退、疟疾寒热等症，尚可佐助黄连解暑，增强白头翁凉血止痢之功，具有较大研究价值。现代药理研究表明，白黄泄热止痢片中白头翁尤善清大肠湿热及血分热毒，对湿热痢疾和热毒血痢有较好的治疗效果，研究多将白头翁皂苷B4作为其质量控制的一个重要指标；黄连主要含生物碱，以盐酸小檗碱的量最高(5%～8%)，且抗菌、抗炎作用较强[2, 3, 4]。秦皮主含秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素等香豆素类化合物，其中，秦皮甲素、秦皮乙素对多种肠道病原菌有很强的抑制作用[5, 6]，可显著抑制大肠杆菌等病原菌的繁殖。青蒿中东莨菪内酯具有抗菌消炎、祛痰止咳的作用，对正常动物体温及大肠杆菌内毒素致热动物体温均有显著的降低作用[7, 8]。鉴于出膏率常作为中药复方提取效果的评价指标，本研究将上述5种成分的溶出量与出膏率作为检测指标，采用层次分析法(AHP)[9]、CRITIC(criteria importance through intercriteria correlation)法及AHP-CRITIC混合加权法确定各指标权重，对正交试验结果进行综合评定，并根据评定结果分析筛选最佳权重系数，进而采用SPSS 19.0软件对最佳权重系数所评估分数进行方差分析，确立白黄泄热止痢片复方最佳提取工艺，为白黄泄热止痢片后续研究开发提供参考。
1 仪器与材料Waters e2695-2998高效液相色谱仪，美国Waters公司；CPA 225D型电子天平，十万分之一，北京赛多利斯科学仪器有限公司；AW220型电子天平，万分之一，日本岛津公司；Millipore Synergy UV型超纯水机，美国Millipore公司。
白头翁(批号140601)，四川博仁药业有限责任公司；黄连(批号131201)、秦皮(批号130601)、青蒿(批号140101)，重庆慧远药业有限公司。4味药材经重庆市中药研究院中药种植研究所李隆云研究院鉴定，白头翁为毛莨科植物白头翁Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel的干燥根，黄连为毛茛科植物三角叶黄连Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao的干燥根茎，秦皮为木犀科植物苦枥白蜡树Fraxinus rhynchophylla Hance的干燥枝皮或干皮，青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L. 的干燥地上部分。对照品白头翁皂苷B4(批号111766-200601)、盐酸小檗碱(批号111895-201303)、秦皮甲素(批号110740-200104)、秦皮乙素(批号110741-200506)、东莨菪内酯(批号110768-200504)均购自中国食品药品检定研究院，经面积归一化法处理，质量分数均＞98%；乙腈、甲醇为色谱纯，美国Tedia公司；乙醇、磷酸、三乙胺为分析纯，重庆川东化工(集团)有限责任公司；水为自制超纯水。
2 方法与结果 2.1 白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、秦皮乙素、东莨菪内酯定量测定 2.1.1 色谱条件色谱柱为Sapphire C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(含0.2%三乙胺)；梯度洗脱：0～25 min，8%～15%乙腈；25～45 min，15%～28%乙腈；45～70 min，28%～33%乙腈；体积流量1.0 mL/min；盐酸小檗碱、秦皮甲素、秦皮乙素、东莨菪内酯检测波长为340 nm，白头翁皂苷B4检测波长为201 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL，色谱图见图 1。
 |
1-秦皮甲素 2-秦皮乙素 3-东莨菪内酯 4-盐酸小檗碱 5-白头翁皂苷B4 1-aesculin 2-aesculetin 3-scopoletin 4-berberine hydrochloride 5-anemoside B4 图 1 对照品、供试品、阴性对照的HPLC图谱Fig.1 HPLCof reference substances,samples,and negative samples |
精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥24 h后的各对照品适量，加甲醇制成分别含白头翁皂苷B4 1 211.0 μg/mL、盐酸小檗碱822.0 μg/mL、秦皮甲素223.0 μg/mL、秦皮乙素154.2 μg/mL、东莨菪内酯16.0 μg/mL的混合对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备(1)提取溶剂考察：精密称取日处方量药材(白头翁9 g、秦皮9 g、黄连9 g、青蒿6 g，下同)共8份，分别加水及10%、30%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇264 mL，回流提取2.0 h，滤过，合并滤液，加提取溶剂定容至1.0 L，得供试液；取供试液适量，12 000 r/min离心5 min，取上清液10 mL，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解并定容至10 mL量瓶中，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
(2)正交试验设计供试品溶液的制备：精密称取日处方量药材共9份，按正交设计表采用60%乙醇加热回流提取，滤过，合并滤液，加60%乙醇定容至1.0 L，得供试液；取供试液适量，12 000 r/min离心5 min，取上清液10 mL，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解并定容至10 mL量瓶中，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得9批供试品溶液，依次记为S1～S9。
2.1.4 阴性样品溶液的制备依次精密称取除白头翁、黄连、秦皮、青蒿外日处方量药材共4份，加60%乙醇264 mL，回流提取2.0 h，滤过，合并滤液，加60%乙醇定容至1.0 L，得各阴性供试液；分别取各阴性供试液适量，12 000 r/min离心5 min，取上清液10 mL，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解并定容至10 mL量瓶中，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得缺白头翁、黄连、秦皮、青蒿4份阴性样品溶液。
2.1.5 线性关系考察精密移取“2.1.2”项下混合对照品溶液适量，配成不同系列质量浓度，精密吸取10 μL按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以对照品进样质量浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到各成分的回归方程、相关系数及线性范围分别为白头翁皂苷B4 Y＝3 737.3 X＋10 963，r＝0.999 9，121.1～1 211.0 μg/mL；盐酸小檗碱Y＝51 038 X－506 569，r＝0.999 9，82.2～822.0 μg/mL；秦皮甲素Y＝22 355 X－28 931，r＝0.999 7，22.3～223.0 μg/mL；秦皮乙素Y＝32 825 X－54 155，r＝0.999 9，15.4～154.2 μg/mL；东莨菪内酯Y＝46 879 X－5 429，r＝0.999 9，1.6～16.0 μg/mL。
2.1.6 精密度试验精密吸取同一混合对照品溶液(“2.1.2”项下对照品溶液5 mL→10 mL)10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，测定各成分色谱峰峰面积。结果白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、秦皮乙素和东莨菪内酯峰面积的RSD分别为0.36%、0.21%、0.27%、0.25%、0.34%，表明仪器精密度良好。
2.1.7 稳定性试验取供试品溶液S3，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h精密吸取10 μL进样分析，测定各成分峰面积。结果白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、秦皮乙素和东莨菪内酯峰面积的RSD分别为0.52%、0.34%、0.33%、0.41%、0.81%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.1.8 重复性试验精密称取日处方量药材共6份，每份加60%乙醇264 mL，加热回流提取3次，每次2.0 h，滤过，合并滤液，加60%乙醇定容至1.0 L，得供试液。取各供试液依法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL进样分析，测定各成分峰面积，并计算其质量分数。结果白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、秦皮乙素和东莨菪内酯质量分数的RSD分别为1.02%、0.61%、1.33%、1.26%、1.44%，表明该方法重复性良好。
2.1.9 加样回收率试验分别精密吸取已测定的供试品溶液S3(白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、秦皮乙素和东莨菪内酯质量浓度依次为609.4、382.3、91.5、6.15、60.4 μg/mL)2.5 mL，共6份，分别置于5 mL量瓶中，分别精密加入对照品溶液(白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、秦皮乙素和东莨菪内酯质量浓度依次为605.5、406.0、111.5、8.0、77.1 μg/mL)2.5 mL，依法测定峰面积并计算各成分加样回收率。
结果白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、秦皮乙素和东莨菪内酯加样回收率分别为101.31%、99.76%、99.23%、100.63%、100.19%；RSD分别为0.37%、0.19%、0.26%、0.42%、0.51%；表明该方法回收率良好。
2.2 出膏率测定精密吸取供试品溶液20.0 mL，置已恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，精密称定质量，根据公式(出膏率＝干膏质量×50/药材质量)计算出膏率。
2.3 提取溶剂考察结果及正交试验设计单因素考察不同提取溶剂加热回流提取时复方中5种指标性成分溶出量的变化，结果见表 1。60%乙醇作为提取溶媒，5种指标性成分溶出量相对较高，因此，选取60%乙醇作为提取溶剂。
|
表 1 不同提取溶剂考察结果 Table 1 Determination of different extraction solvents |
根据药物性质并结合生产实际，以溶剂用量(A)、提取时间(B)和提取次数(C)为考察因素，安排L9(34) 正交试验，因素水平见表 2。
|
|
表 2 L9(34)正交试验设计与结果 Table 2 Design and results of L9(34) orthogonal test |
精密吸取“2.1.3(2)”项下供试品溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，依法测定药材中5种成分的溶出量和出膏率，结果见表 2。
2.5 指标权重的确立 2.5.1 AHP法确定权重根据复方中药味君臣佐使配伍规律及各成分药理作用强弱，本实验将出膏率和指标性成分溶出量作为权重指标予以量化，即将6项指标分成5个层次，并确定各指标的优先顺序：白头翁皂苷B4＞盐酸小檗碱＞秦皮甲素＝秦皮乙素＞东莨菪内酯＞干膏得率，构建成对比较的判断优先矩阵，赋予各项指标间的相对评分，指标成分比较的优先矩阵见表 3。
|
|
表 3 指标成对比较的判断优先矩阵 Table 3 Priority matrix for comparison on index pairs |
根据表 3评分结果，AHP法计算得到白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、秦皮乙素、东莨菪内酯和出膏率6项指标权重系数分别为0.365 7、0.234 5、0.139 6、0.078 3、0.139 6、0.042 4，一致性比例因子(CR)＝0.013＜0.10，即指标优先比较判断矩阵具有满意的一致性，权重系数有效[10]。
2.5.2 CRITIC法确定权重中药复方在提取过程中配伍的变化及成分间的相互作用致使各指标性成分对复方总体提取效果的贡献不同，主观确定其权重系数有失偏颇。考虑到CRITIC法是一种以评价指标间的对比强度及冲突性作为基础，通过计算标准差将对比强度体现出来的客观反映指标权重值的计算方法，本研究欲采用CRITIC法确定各指标间权重，通过与AHP法和AHP-CRITIC法的分析比较，说明各权重确定方法间的一致性和差异性。将表 3中试验数据经线性插值处理[指标成分值＝(实测值－最小值)/(最大值－最小值)×100]，消除单位量纲后，计算各指标对比强度(si)、冲突性(δi)、综合权重(ci)与权重(ωi)[11, 12]，结果见表 4。
|
|
表 4 相关计算数据 Table 4 Relevant calculation data |
由表 4可知，白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、东莨菪内酯、秦皮乙素、出膏率6项指标经CRITIC法计算得到的权重系数分别为0.103 8、0.119 7、0.251 4、0.189 7、0.229 0、0.106 4。
2.5.3 AHP-CRITIC混合加权法确定权重根据白黄泄热止痢片治疗肠热泄泻、小便赤涩的特点，AHP法量化了评价指标两两间比较判断的优先信息，得到了以主观评价为基础的权重系数，基本体现了白黄泄热止痢片治疗肠热泄泻、小便赤涩的各指标的主次顺序；又采用CRITIC法求得相应指标的客观权重系数，这不仅考虑到了各样本数据的变异性及指标间的相关性对赋权的影响，而且避免了主观赋权存在的偏颇。但评估权重既要注重客观，又要不失主观，故而将二者结合起来，计算综合权重(ω综和ij)＝ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij，以期评价结果更加客观、真实。按上述公式计算得白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、东莨菪内酯、秦皮乙素、出膏率6项指标权重系数分别为0.249 0、0.184 1、0.230 2、0.0974、0.209 7、0.029 6。
2.6 综合评价结果的比较分别采用经AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC混合加权法分析得到的权重系数对实验结果进行综合评分，结果见表 5。直观分析，3种评分方法结果间差异较小；通过相关系数分析，AHP法与CRITIC法之间的相关系数为0.991，AHP法与混合加权法之间的相关系数为0.997，CRITIC法与混合加权法之间的相关系数为0.997，三者相关性显著(P＜0.05)，即3种赋权法得到的评分结果具备一致性。
|
|
表 5 3种赋权法综合评分结果 Table 5 Synthetical scores of three methods applying weighted coefficient |
但是从权重系数分析，AHP法与CRITIC法之间的相关系数为-0.371，二者呈负相关，相关性不显著(P＞0.05)，所反映的信息不具叠加性。相比之下，AHP-CRITIC混合加权法从主、客观2个方面加以考虑，所体现的信息量也就更为全面，因此综合评分结果更为科学、合理，更接近实际情况。
2.7 提取工艺的确定采用AHP-CRITIC混合加权法得到的权重系数对实验结果进行综合评分(表 5)；利用SPSS 19.0对正交试验结果进行分析，直观分析结果见表 6，方差分析结果见表 7。直观分析可知，各因素对白黄泄热止痢片醇提工艺作用主次为C＞A＞B，方差分析表明，C因素对试验结果具有显著影响(P＜0.05)。取各因素较高水平的组合，得最佳工艺参数A2B3C3，即8倍量60%乙醇加热回流提取3次，每次2.0 h。
|
|
表 5 直观分析 Table 5 Intuitive analysis |
|
|
表 7 方差分析 Table 7 Analyses of variance |
精密称取处方量药材3份，按最佳工艺A2B3C3条件进行提取，测定白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、秦皮乙素、东莨菪内酯的溶出量，计算出膏率，结果见表 8。
|
|
表 8 验证试验结果 Table 8 Verification testing results |
由表 8可知，3批验证试验综合评分均达97.56以上，RSD为0.432%，且3批样品各指标性成分溶出量RSD均小于2.051%，组间无显著性差异，表明该工艺稳定可行，重复性良好，可用于白黄泄热止痢片工业化提取。
3 讨论中药复方以中医药理论为指导，充分体现了中医整体论治的思想，也逐渐形成了生物活性物质为其主成分群的观念。基于此，本研究将复方中药效确切、研究较多的白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱、秦皮甲素、东莨菪内酯、秦皮乙素5种成分与出膏率共同作为检测指标进行评定，以多指标综合加权评分法优选白黄泄热止痢片提取工艺，具有可行性。
权重系数的确立一直是中药提取工艺多指标评价需要考虑的问题。查阅文献发现，应用较多的是主观赋权法、AHP赋权法。值得肯定的是，此类方法在一定程度上体现了中药复方的配伍特点，但主观性也较强，易受专家或学者知识深度和广度的影响，仅凭专家个人判断，难免带有片面性而忽略了实际样本数据的信息。相比之下，CRITIC法能体现客观数据信息，却往往忽视指标间的轻重关系。鉴于中药复方配伍存在“君臣佐使”，CRITIC法就表现出对样本的区分度不够，可见CRITIC法没有AHP法赋权合理。而AHP-CRITIC混合加权法融合了不同类型赋权方法的优点，在保持权重稳定性的同时，更能区分样本数据，保证数据点均匀分散，实验结果稳定可靠。因此，本研究结合中药复方提取工艺的特点和实际情况，采用AHP-CRITIC混合加权法赋权，建立了科学、合理的综合评价指标，经SPSS 19.0方差分析筛选出稳定、可行、高效的白黄泄热止痢片醇提工艺，为以后制剂成型和工业化大生产提供了数据支撑，具有较大实际应用价值。
| [1] | 黄甫中. 明医指掌(订补本)[M]. 北京:人民卫生出版社, 1982. |
| [2] | 杨勇, 叶小利, 李学刚. 4种黄连生物碱的抑菌作用[J]. 时珍国医国药, 2007, 18(12):3013-3014. |
| [3] | Gu L L, Li N, Li Q R, et al. The effect of berberine in vitro on tight junctions in human Caco-2 intestinal epithelial cells[J]. Fitoterapia, 2009, 80(4):241-248. |
| [4] | Cheng Z F, Zhang Y Q, Liu F C. Berberine against gastrointestinal peptides elevation and mucous secretion in hyperthyroid diarrheic rats[J]. Regul Peptide, 2009, 155(1):145-149. |
| [5] | Zhou L, Kang J, Fan L, et al. Simultaneous analysis of coumarins and secoiridoids in Cortex Fraxini by highperformance liquid chromatography-diode array detection-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed, 2008, 47(1):39-46. |
| [6] | Duncan S H, Flint H J, Stewart C S. Inhibitory activity of gut bacteria against Escherichia coli O157 mediated by dietary plant metabolites[J]. FEMS Microbiol Lett, 1998, 164(2):283-288. |
| [7] | 杨柯, 林启云, 赵一, 等. 东莨菪素对家兔体温的影响[J]. 广西中医药, 2005, 28(1):62. |
| [8] | 杨柯, 曾春晖. 莨菪亭解热作用机理实验研究[J]. 中国药物应用与监测, 2006(3):24-27. |
| [9] | 李军, 于翔, 龚元, 等. 正交试验法优选菲牛蛭饲料配方研究[J]. 中草药, 2014, 45(6):782-785. |
| [10] | 石振武, 赵敏. 运用层次分析法确定指标的权值[J]. 科技和产业, 2008, 8(2):23-25. |
| [11] | 贺佳, 高尔生. 综合评价中权重系数及标准化方法的研究[J]. 中国公共卫生, 2001, 17(11):1048-1050. |
| [12] | 郭真, 于丽红, 兰庆高. 村镇银行可持续发展评价指标体系的构建——基于对湖南湘乡市村镇银行的调查[J]. 金融理论与实践, 2011(5):53-56. |