珍珠明目滴眼液主要由珍珠液和冰片配伍制成，是国家食品药品监督管理局批准的二级中药保护品种，收载于《中药成方制剂》第17册，其主要功能为清热泻火、养肝明目，主要用于肝虚火旺引起视力疲劳症和慢性结膜炎，长期使用可以保护视力^{[1, 2, 3, 4]}。珍珠液作为珍珠明目滴眼液的原料药，主要有效成分为蛋白多肽。

目前，市售珍珠液的生产工艺主要有水直接提取、酸/酶水解提取，提取方法的差异易造成珍珠液中肽类成分的不同；珍珠液的现行标准中未明确生产工艺，多肽类成分采用紫外分光光度(UV)法测定总蛋白量，方法专属性差，难以鉴别珍珠液中的肽，而且珍珠液的制备工艺不同亦会引起肽类成分的差异。而珍珠明目滴眼液现行质量标准中关于蛋白多肽类成分的控制仅有氨基酸的鉴别项。工艺的不确定及质量标准的不专属，都无法保证制剂质量的稳定。目前，HPLC-MS技术已经被广泛用于各种生物样品中各种肽的鉴定和测定^{[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]}，此外，采用酸水解样品经异硫腈酸苯酯(PITC)柱前衍生HPLC-UV方法多用于中药制剂中蛋白类成分的定量测定^{[16, 17, 18, 19]}。

因此，本研究采用UPLC-Q-TOF MS鉴定不同厂家珍珠明目滴眼液制剂及珍珠液中的多肽，柱前衍生化RP-HPLC法测定滴眼液制剂中16种氨基酸，通过肽的相对分子质量(M_W)及氨基酸相对质量浓度的百分比来比较不同生产企业产品中肽类成分的差异，评价不同生产企业制剂及原料药生产工艺，为确保原料药生产工艺的稳定性及有效地控制珍珠明目滴眼液的质量提供参考依据。

Ultimate-3000高效液相色谱仪，Phenomenex Gemini C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Waters Acquity UPLC-G2-Q-TOF液质联用仪，Acquity UPLC BEH C₁₈(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色谱柱；DHG-90738S-III型电热恒温鼓风干燥箱，天津市中环实验电炉有限公司；Mettler Toledo XP205电子天平；DELTA-320 pH计；冷冻干燥机，上海合康实业有限公司。

异硫氰酸苯酯(PITC)，批号NG162899，Thermo Scientific公司；乙腈为色谱纯；甲酸为电子级；葡聚糖凝胶G25，上海源叶生物科技有限公司；水为双蒸水；乙腈、正己烷、三乙胺为色谱纯，无水醋酸钠、醋酸、盐酸均为分析纯。

Waters公司的17种氨基酸液体混合对照品溶液(Waters公司，批号50G187498)，其中天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)浓度为2.5 μmol/mL，胱氨酸(Cys)浓度为1.25 μmol/mL。

5家生产企业的珍珠液各1批及7家生产企业共95批的珍珠明目滴眼液信息见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 不同生产企业原料药及制剂 Table 1 Raw material and preparation from different manufacturers 序号 珍珠液 (原料药) 珍珠明目滴眼液 (制剂) 制剂批数 1 A厂 A1(A厂产品) 10 2 B厂 B1(B厂产品) 20 3 C厂 － 4 D厂 D1(D厂产品) 19 5 E厂 E1(E厂产品) 20 6 － F厂 5 7 － G厂 3 8 － H厂 18

表 1 不同生产企业原料药及制剂 Table 1 Raw material and preparation from different manufacturers

取5个厂家提供的珍珠液，经0.22 μm的微孔滤膜滤过，直接质谱进样。

取7个不同厂家的珍珠明目滴眼液各40 mL，冷冻干燥，获得固体粉末，采用1 mL水复溶，将样品过G25凝胶柱，收集馏出液，0.22 μm滤膜滤过，进样。

色谱柱为Acquity UPLC BEH C₁₈柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～50 min，1%～99%乙腈；柱温30 ℃；体积流量0.2 mL/min；进样量为2 μL。

ESI正负离子模式，锥孔电压40 V，毛细管电压2 600 V，离子源温度100 ℃，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气体体积流量600 L/h。采集方式MSE，采集时间40 min。质量扫描范围m/z 100～5 000。碰撞能量：低能量6 V，梯度高能量20～30 V。碰撞气体：高纯氩气。

氨基酸测定方法采用柱前衍生化RP-HPLC法。色谱条件、柱前衍生化方法，氨基酸混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液的制备方法均参考郑丽慧等^[20]建立的方法。

从5家企业珍珠液UPLC-Q-TOF MS测定的基峰离子流(base peak ion，BPI)图(图 1)中可看出，5家企业珍珠液的相同点为均明显可见肽类主要成分峰(峰1～4)，但其量明显不同，从图 2(峰1～6的MS图)中可得出峰1的M_W为960、峰2的M_W为1 093、峰3的M_W为772、峰4的M_W为986。A和B 2家企业的珍珠液与其他3家企业生产的明显不同，可见峰5、6，此2峰呈现多肽类成分簇状峰，采用Mass Ent 3软件对此2峰计算M_W，结果显示，峰5的M_W约为2 622、峰6的M_W约为4 746。

图 1 5家生产企业珍珠液的BPI图 Fig.1 BPI figures of Zhenzhuye from five manufacturers

图 2 峰1～6的MS图 Fig.2 Massspectrograms of peak 1—6

按上述色谱峰的分析结果，对5家企业珍珠液中肽类成分的M_W分布进行分析，并与其制备工艺相对应，结果见表 2。此研究结果表明，原料珍珠液存在2种明显不同的制备工艺，一种是直接水提，所得肽类成分的M_W范围较广，多为多肽类成分；另一种是酸、酶水解，所得多为寡肽，M_W多在1 000及以下。

表 2(Table 2)

表 2 5家生产企业珍珠液中多肽的MW Table 2 MW of polypeptide in Zhenzhuye from five manufacturers 样品 编号 生产 厂家 肽相对分子 质量分布 制备工艺 (企业提供) 1 A厂 519～4 746 水提 2 B厂 519～4 746 水提 3 C厂 597～872 酸、酶水解 4 D厂 532～1 093 酸、酶水解 5 E厂 525～1 303 酸、酶水解

表 2 5家生产企业珍珠液中多肽的MW Table 2 MW of polypeptide in Zhenzhuye from five manufacturers

从7个厂家样品的UPLC-Q-TOF MS测定的总离子流色谱图(total ions chromatogram，TIC，图 3)中可看出，各厂家样品中的肽类主要成分峰分为3个区域，其中A1和F厂样品的肽类成分主要集中在区域2和3，D1和E1厂样品的肽类成分主要集中在区域1和2，而另外3个厂家G、B1、H样品则只在区域2有肽类成分。

图 3 7个厂家滴眼液的多肽TIC图 Fig.3 TIC spectra of polypeptide in eye drops from seven manufacturers

区域1中不同保留时间(t_R)峰的MS图见图 4。t_R在5.416 min的肽M_W为1 094；t_R在9.249 min的肽M_W为1 300。从图中可看出，此区域肽类成分的M_W在1 000左右。

图 4 区域1中tR 5.416 min (a) 和tR 9.249 min (b) 肽的MS图 Fig.4 Mass spectrograms of peaks tR at 5.416 (a) and 9.249 min (b) in zone 1

区域2中不同t_R峰的MS图见图 5。图中t_R为18.379 min(c)、18.766 min(d)、21.235 min(e)、21.673 min(f)的4个峰均呈多肽类成分簇状峰。

图 5 区域2中不同tR峰的MS图 (c～f) Fig.5 Mass spectra of peaks at different tR (c—f) in zone 2

区域3中不同t_R峰的MS图见图 6。图中t_R为25.993 min(g)、27.099 min(h)、27.407 min(i)的3个峰均呈多肽类成分簇状峰。

图 6 区域3不同tR峰MS图 (g～i) Fig.6 Massspectraof peaks at different tR (g—i) in zone 3

采用Mass Ent 3软件对图 3中的1、2、3区域中峰的M_W进行计算，7家生产企业的滴眼液中肽类成分的M_W分布结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 7个厂家滴眼液中肽类成分的MW Table 3 MW of polypeptide in eye drops from seven manufacturers 厂家 肽相对分子质量 1区域 (5～10 min) 2区域 (17～22 min) 3区域 (25～30 min) A1 665.6～1 169.2 1 975.7～4 793.6，量较高 8 534.8～9 814.8 F — 1 017.8～4 895.5，量较高 4 368.3～9 814.8 G — 1 017.8～4 895.5，量较低 — B1 — 1 017.8～4 895.5，量较低 — H — 1 017.8～4 895.5，量较低 — D1 149.0～1 300.6 1 017.8～4 895.5，量较低 — E1 149.0～1 094.5 1 017.8～4 895.5，量较低 —

表 3 7个厂家滴眼液中肽类成分的MW Table 3 MW of polypeptide in eye drops from seven manufacturers

5个生产企业提供的珍珠液经柱前衍生RP- HPLC法测定16种氨基酸分别占总氨基酸量百分比的结果见表 4，16种氨基酸中Gly百分比最高，其他氨基酸百分比不同厂家不尽相同。95批不同厂家的珍珠明目滴眼液中16种氨基酸占总氨基酸量百分比的平均值结果见表 5，其中Gly的百分比最高，与珍珠液结果一致，但不同厂家之间的差异比珍珠液中Gly的差异显著。

表 4(Table 4)

表 4 5家生产企业珍珠液中各氨基酸占总氨基酸量百分比 Table 4 Percentages of every amino acid to total content of 16 amino acids in zhenzhuye from 5 manufacturers 氨基酸 占比/% A B C D E Asp 5.451 2.835 4.087 0.925 1.784 Glu 7.451 11.339 8.456 4.311 6.762 Ser 8.418 3.622 5.691 4.450 2.096 Gly 26.440 23.858 26.589 26.022 30.785 His 0.857 0.787 0.797 0.731 0.508 Arg 7.604 11.181 8.052 12.590 14.719 Thr 2.110 1.811 2.220 2.572 1.204 Ala 11.560 15.906 8.809 11.563 9.911 Pro 3.670 10.157 10.030 14.561 14.264 Tyr 4.044 0.945 1.090 1.138 1.365 Val 3.648 2.756 3.592 3.414 1.525 Met 2.330 2.677 2.311 2.294 0.865 Ile 5.429 1.417 6.206 1.952 2.007 Leu 4.220 3.622 2.119 4.496 0.955 Phe 5.802 2.283 3.401 2.997 5.085 Lys 0.989 4.803 6.599 6.013 6.146

表 4 5家生产企业珍珠液中各氨基酸占总氨基酸量百分比 Table 4 Percentages of every amino acid to total content of 16 amino acids in zhenzhuye from 5 manufacturers

表 5(Table 5)

表 5 7家生产企业滴眼液中各氨基酸占总氨基酸量百分比 Table 5 Percentages of every amino acid to total content of 16 amino acids in eye drops from seven manufacturers 氨基酸 占比/% A1 F G B1 H D1 E1 Asp 2.330 3.718 6.832 1.947 3.839 1.263 0.929 Glu 3.224 1.007 7.047 3.012 2.448 3.780 3.214 Ser 9.745 5.728 4.963 7.687 7.364 3.307 3.375 Gly 28.838 34.407 25.028 20.439 25.347 50.718 46.631 His 2.388 2.101 1.944 6.488 4.506 0.836 0.766 Arg 6.418 6.531 9.139 8.687 5.591 8.434 8.208 Thr 2.258 2.995 1.698 4.968 4.084 1.430 1.384 Ala 12.602 6.004 8.261 9.879 15.673 8.062 8.384 Pro 4.462 4.167 3.624 6.918 4.574 10.429 11.604 Tyr 4.260 9.633 5.828 5.910 3.678 0.870 0.974 Val 3.197 3.264 2.758 3.359 2.270 1.833 2.530 Met 0.886 0.181 0.966 0.925 0.246 0.470 0.455 Ile 2.131 2.718 1.754 1.579 1.865 0.881 1.269 Leu 6.042 9.844 10.081 5.127 7.258 2.435 3.100 Phe 7.200 4.979 5.415 8.050 7.373 1.851 2.309 Lys 4.019 2.722 4.663 5.026 3.883 3.401 4.869

表 5 7家生产企业滴眼液中各氨基酸占总氨基酸量百分比 Table 5 Percentages of every amino acid to total content of 16 amino acids in eye drops from seven manufacturers

将珍珠液和滴眼液中Pro与Ala的质量浓度测定结果作比值分析，结果见图 7，图中C、D、E厂比值均大于1，其中D和E厂珍珠液原料药制备工艺来自C生产厂家，生产企业提供的珍珠液制备工艺为酸/酶水解提取工艺。而其他厂家的远低于1，采用水提取工艺。通过Pro与Ala质量浓度比值能够对珍珠液的生产工艺进行区分。

图 7 不同厂家珍珠液和滴眼液中Pro与Ala质量浓度比值Fig.7 Content ratios of proline/alanine in Zhenzhuye and eye drops from different manufacturers

通过UPLC-Q-TOF MS测定不同厂家珍珠液原料药和滴眼液制剂中多肽类成分的M_W，发现不同厂家样品间差异较大。一般肽中含有的氨基酸的数目为2～9，根据肽中氨基酸数量的不同，肽通常被命名为二肽到九肽。M_W段在50～1 000的称为小肽、寡肽、低聚肽，也称为小分子活性多肽。由10～100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，M_W段在5 000～10 000，能透过半透膜；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质，蛋白质有时也被称为多肽。眼球视网膜上的视紫质由蛋白质组成，蛋白质缺乏，可导致视紫质合成不足，进而出现视力障碍。可见，滴眼液中的多肽对眼睛起着重要的保护作用。多肽的M_W分布测定结果表明，不同企业的滴眼液中含高M_W多肽的2个厂家A1和F厂的样品质量较好。

氨基酸测定结果表明，Pro与Ala质量浓度的比值可用于区分珍珠液的不同制备工艺，目前珍珠液的生产工艺主要有水直接提取、酸/酶水解提取，Pro/Ala＜1为水直接提取工艺，Pro/Ala＞1为酸/酶水解工艺。结合多肽分析结果，水直接提取工艺制备珍珠液，其肽类成分M_W段在500～5 000，较易通过眼球半透膜，可保证滴眼液制剂质量的有效性。

通过本研究，建议修订珍珠液质量标准，明确制备工艺为水直接提取，珍珠液及珍珠明目滴眼液质量标准增加Pro与Ala质量浓度的比值为检查项，总氨基酸测定为定量测定项，以有效控制珍珠明目滴眼液的质量，确保其质量的稳定性和有效性。