透骨草Viciae Amoenae Herba为中医外科较常用药，始见于《救荒本草》。其功效祛风除湿、活血止痛，临床上用于湿疼痛、疮疡肿毒等^[1]。《中国药典》2010年版附录中规定透骨草来源为豆科植物狭山野豌豆Vicia amoena Fisch. var. angusta Freyn、山野豌豆Vicia amoena Fisch.、假香野豌豆Vicia pseudo-orobus Fisch. et Mey、广布野豌豆Vicia cracca L. 或毛山野豌豆Vicia amoena Fisch. var. sericea Kitag. 的干燥地上部分^[2]。《黑龙江省中药材标准》中收载了黑龙江野豌豆Vicia amurensis Oett. ^[3]。透骨草品种混乱，同名异物现象严重^{[4, 5]}，通过辽宁省中药资源普查发现辽宁地区市场上流通的透骨草药材正品主要以狭山野豌豆居多、加之主要存在歪头菜、北野豌豆等伪品，凤仙花、地构叶、黄花铁线莲等替代品。蔡少青等^[6]对8种透骨草进行研究发现，其化学成分不同，功效也有差异。因此，确保透骨草临床用药安全有效，提升透骨草的质量控制方法是十分必要的。中药及指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，克服了依赖部分指标成分鉴定中药制剂质量的局限性，能够较全面地反映药材的化学成分及特征，可用于中药材一致性评价及整体质量控制^[7]。目前关于透骨草的研究报道较少，为了全面评价透骨草的质量并确保临床用药的安全有效，本实验首次应用UPLC建立10批不同产地狭山野豌豆的指纹图谱，利用UPLC-ESI-Q-TOF-MS指认其色谱峰，在数据化处理的基础上，结合相似度评价的方法，比较和鉴别透骨草药材其余5种来源品种，以反映不同来源的样品化学成分的变化，为透骨草药材的质量控制提供理论依据以及为《中国药典》透骨草药材统一标准的建立奠定基础。

Agilient UPLC（Agilent 1290 Infinity系统，包括二极管阵列检测器、色谱柱温箱、自动进样器、在线脱气机、二元高压梯度泵）；四级杆-飞行时间质谱仪（Agilent 6560 Q-TOF），配有ESI电离源接口；HH-4数显恒温水浴锅（上海蓝凯仪器仪表有限公司）；ACCULAB ALC-11C 4型电子天平（德国赛多利斯集团）；DFT-200 型粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

对照品槲皮苷（批号111538-200504）、金丝桃苷（批号111521-201406）、杨梅苷（批号111860-201102）、绿原酸（批号110753-201314）、异槲皮苷（批号111809-201403）、山柰苷（批号111775-200701）均购于中国食品药品检定研究院。乙腈、甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），其他试剂（分析纯）。

透骨草药材均自采，经辽宁省食品药品检验检测院王维宁教授鉴定为豆科植物狭山野豌豆Vicia amoena Fisch. var. angusta Freyn、山野豌豆Vicia amoena Fisch.、假香野豌豆Vicia pseudo-orobus Fisch. et Mey.、广布野豌豆Vicia cracca L.、毛山野豌豆Vicia amoena Fisch. var. sericea Kitag、黑龙江野豌豆Vicia amurensis Oett. 的干燥地上部分。样品信息见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 透骨草样品信息 Table 1 Sample information of Viciae Amoenae Herba 编号 名称 产地 采集时间 S1 狭山野豌豆 朝阳县木头城子 2013-07-31 S2 狭山野豌豆 朝阳市建平县 2013-08-01 S3 狭山野豌豆 大连市长兴岛 2013-08-15 S4 狭山野豌豆 营口鲅鱼圈小河子村 2013-07-15 S5 狭山野豌豆 营口市大石桥 2013-07-16 S6 狭山野豌豆 千山彭家岭路边荒地 2013-07-20 S7 狭山野豌豆 辽阳县下达河乡大牛岭村 2013-07-31 S8 狭山野豌豆 岫岩县偏岭镇王家堡子村 2013-08-08 S9 狭山野豌豆 抚顺县三块石 2013-07-18 S10 狭山野豌豆 辽阳县榆树屯路旁 2013-07-31 S11 山野豌豆 抚顺市高弯区王爰水库 2013-07-08 S12 山野豌豆 西丰县钓鱼乡吉川屯 2014-07-05 S13 山野豌豆 抚顺县三块石 2013-07-09 S14 假香野豌豆 棋盘山经济技术开发区 2013-07-08 S15 假香野豌豆 抚顺县三块石佟村 2013-07-17 S16 假香野豌豆 新宾县南杂木镇 2013-07-18 S17 广布野豌豆 抚顺县马圈子天女栏沟 2013-07-07 S18 广布野豌豆 新宾县南杂木镇 2013-07-18 S19 广布野豌豆 本溪市本溪县温泉寺 2014-06-10 S20 毛山野豌豆 阜新蒙古族自治县 2013-08-07 S21 毛山野豌豆 阜新市彰武县阿尔乡 2013-08-08 S22 毛山野豌豆 西丰县钓鱼乡 2014-08-08 S23 黑龙江野豌豆 新宾县南杂木镇 2013-07-18 S24 黑龙江野豌豆 抚顺马圈子天女栏沟 2013-07-17 S25 黑龙江野豌豆 西丰县宝兴水库 2014-07-10

表 1 透骨草样品信息 Table 1 Sample information of Viciae Amoenae Herba

色谱柱：Eclipse Plus C₁₈ RRHD（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱（洗脱程序为0～7 min，5%～10% B，7～11 min，10%～13% B，11～20 min，12%～13% B，20～25 min，12%～19% B，25～32 min，19%～26% B），检测波长340 nm，柱温30 ℃，体积流量0.2 mL/min，进样量2 μL。

采用ESI离子源，负离子模式下分别采集数据。离子源参数：毛细管电压：3 500 V，毛细管电流：5.834 μA；干燥气温度：225 ℃，干燥气体积流量：13 L/min，雾化器压力：206.85 kPa（30 psi），鞘气温度：400 ℃，鞘气体积流量：12 L/min；碎裂电压：365 V，质量扫描范围m/z 100～1 500。

精密称定对照品绿原酸、杨梅苷、金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷适量，加入甲醇分别制备含0.020、0.055、0.037、0.063、0.078、0.109 mg/L 的混合对照品溶液。

取样品粉末（过40目筛）约1 g，精密称定，置于150 mL圆底烧瓶中，加入70%甲醇80 mL，回流2 h，提取液回收甲醇蒸干，残渣加70%甲醇转移至10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

取同一份（S1）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算各主要共有峰的相对保留时间的RSD＜1.06%，各主要共有峰的相对峰面积的RSD＜2.1%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。

取同一份（S1）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样检测，各主要色谱峰的相对保留时间的RSD＜1.15%，各主要共有峰的相对峰面积的RSD＜2.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

取同一批样品（S1）共6份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法分别进样检测，各主要色谱峰的相对保留时间的RSD＜1.22%，各主要共有峰的相对峰面积的RSD＜2.4%，表明该方法重复性良好。

取10批不同产地的狭山野豌豆样品，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样检测，记录色谱图，共获得14个共有峰。使用《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件》2004版（A）对10个不同产地狭山野豌豆药材的实验数据采用中位数法生成对照图谱，得到10批狭山野豌豆药材特征图谱，见图 1。

图 1

Fig. 1

2-绿原酸 7-杨梅苷 8-金丝桃苷 10-异槲皮苷 12-山柰苷 13-槲皮苷 2-chlorogenic acid 7-myricitrin 8-hyperoside 10-isoquercitrin 12-kaempferitrin 13-quercitrin 图 1 混合对照品 (A) 和10批狭山野豌豆 (B) 的UPLC指纹图谱以及对照指纹图谱 (R) Fig. 1 UPLC fingerprints of mixture reference substances (A),10 batches of V. amoena var. angusta (B),and reference fingerprint (R)

在各批次样品色谱图中13号峰（槲皮苷）分离良好，峰形稳定，峰面积较大且为所有样品共有，所以确定13号峰为参比峰（S），相对保留时间和相对峰面积见表 2和3。

表 2 (Table 2)

表 2 10批狭山野豌豆指纹图谱中共有峰的相对保留时间 Table 2 Relative retention time of common peaks in fingerprint spectra of 10 batches of V. amoena var. angusta 峰号 相对保留时间 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 1 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 2 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 3 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.41 0.42 0.41 4 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 5 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.53 0.54 0.54 6 0.62 0.62 0.61 0.62 0.62 0.62 0.62 0.61 0.62 0.62 7 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.66 0.66 0.67 0.66 8 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 9 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 10 0.78 0.78 0.78 0.78 0.77 0.77 0.78 0.78 0.78 0.77 11 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 12 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 13 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 14 1.14 1.14 1.14 1.13 1.14 1.14 1.14 1.13 1.13 1.13

表 2 10批狭山野豌豆指纹图谱中共有峰的相对保留时间 Table 2 Relative retention time of common peaks in fingerprint spectra of 10 batches of V. amoena var. angusta

表 3 (Table 3)

表 3 10批狭山野豌豆指纹图谱中共有峰的相对峰面积 Table 3 Relative peak areas of common peaks in fingerprint spectra of 10 batches of V. amoena var. angusta 编号 相对峰面积 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 1 0.07 0.03 0.09 0.16 0.21 0.02 0.05 0.06 0.03 0.10 2 0.44 0.09 1.09 0.79 1.21 0.19 0.25 0.17 0.25 0.81 3 0.14 0.06 0.25 1.43 0.11 0.07 0.19 0.07 0.08 0.13 4 0.38 0.05 0.44 0.25 0.23 0.17 0.20 0.15 0.22 0.37 5 0.79 0.09 3.24 2.96 0.53 0.15 0.20 0.26 0.30 0.69 6 0.23 0.04 0.50 0.33 0.26 0.07 0.14 0.08 0.11 0.25 7 0.90 0.19 0.42 0.51 0.31 0.35 0.44 0.36 0.48 0.47 8 0.26 0.10 0.36 0.40 1.38 0.47 0.22 0.13 0.44 0.76 9 0.44 0.09 1.30 1.73 1.74 0.21 0.27 0.17 0.26 1.00 10 0.45 0.19 0.75 0.62 1.55 0.70 0.33 0.24 0.63 0.94 11 0.30 0.12 0.41 0.48 0.32 0.16 0.21 0.16 0.19 0.31 12 0.73 0.45 0.56 0.59 0.30 0.37 0.83 0.52 0.47 0.45 13 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 14 0.41 0.53 0.15 0.29 0.20 0.26 0.43 0.50 0.29 0.32

表 3 10批狭山野豌豆指纹图谱中共有峰的相对峰面积 Table 3 Relative peak areas of common peaks in fingerprint spectra of 10 batches of V. amoena var. angusta

为进一步确认狭山野豌豆特征峰的化学信息，采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS对14个共有峰中的6个色谱峰进行了指认，通过查阅文献数据^{[8, 9, 10, 11, 12, 13]}及与对照品对照，分别鉴定为绿原酸（2号峰）、杨梅苷（7号峰）、金丝桃苷（8号峰）、异槲皮苷（10号峰）、山柰苷（12号峰）、槲皮苷（13号峰）。结果见表 4。

表 4 (Table 4)

表 4 狭山野豌豆指纹图谱中共有峰的指认 Table 4 Identification of common peaks in fingerprint spectra of V. amoena var. angusta 峰号 保留时间/min 准分子离子峰 [M＋H]+ 分子式 化合物 2 6.011 353.087 9 C16H18O9 绿原酸 7 17.298 463.088 2 C21H20O12 杨梅苷 8 18.427 463.088 9 C21H20O12 金丝桃苷 10 20.139 463.088 8 C21H20O12 异槲皮苷 12 24.480 577.156 6 C27H30O14 山柰苷 13 25.154 447.092 7 C21H20O11 槲皮苷

表 4 狭山野豌豆指纹图谱中共有峰的指认 Table 4 Identification of common peaks in fingerprint spectra of V. amoena var. angusta

根据国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》版（2004 A），对10批狭山野豌豆药材的进行相似度计算。结果表明，10批样品S1～S10与对照图谱的相似度依次为0.927、0.986、0.819、0.793、0.786、0.933、0.973、0.980、0.945、0.915。由此可知，S1、S2、S6、S7、S8、S9、S10相似度均＞0.9，说明各产地的药材具有较高的均一性，相似度良好。但S3（大连长兴岛）、S4（营口鲅鱼圈）、S5（营口大石桥）3个产地狭山野豌豆相似度低于0.9。S3、S4、S5 主要生长在辽宁省南部地区，为沿海城市，环境偏潮湿，可能是引起相似度低的主要原因。这表明不同产地狭山野豌豆药材存在差异，但是其质量具有一致性。物种的物侯期不同，当地气温、地理位置等生态环境不同都可能会直接影响药材质量。

本实验在对狭山野豌豆UPLC指纹图谱研究的基础上，对透骨草其他5种来源的山野豌豆（S11～S13）、假香野豌豆（S14～S16）、广布野豌豆（S17～S19）、毛山野豌豆（S20～S22）、黑龙江野豌豆（S23～S25）按照“2.4”项的供试品溶液制备方法和“2.1”项检测方法分别进样测定，通过相似度软件，得到5种野豌豆的UPLC共有模式图。以10批狭山野豌豆的共有模式为基准，计算狭山野豌豆与山野豌豆、假香野豌豆、广布野豌豆、黑龙江野豌豆、毛山野豌豆共有模式的相似度，结果分别为0.689、0.730、0.449、0.247、0.559、0.464。从图 2可以看出，狭山野豌豆与山野豌豆、毛山野豌豆的HPLC图谱共有模式在色谱峰的峰形、主要峰的相对保留时间和相对峰面积存在相似，而与假香野豌豆、广布野豌豆、黑龙江野豌豆存在较大差异。

图 2

Fig. 2

1-狭山野豌豆 2-山野豌豆 3-假香野豌豆 4-广布野豌豆 5-黑龙江野豌豆 6-毛山野豌豆 1-V. amoena var. angust 2-V. amoena 3-V. pseudorobus 4-V. cracca 5-V. amurensis 6-V. amoena Fisch. var. sericea 图 2 透骨草5种来源样品与狭山野豌豆UPLC图共有模式的比较 Fig. 2 Comparison onmutual pattern of UPLC between five different species from Vicia L. and V.amoena var. angusta

本实验选择了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，结果表明以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，各色谱峰的峰形和分离度均优于其他流动相系统。在最佳提取条件，采用UPLC-DAD检测分析发现，在340 nm波长处指纹峰较多，多数特征成分的响应值较大，而且基线较平稳，故选择340 nm作为指纹图谱检测波长。在供试品溶液制备方法中对提取溶剂（50%、60%、70%、80%甲醇）、溶剂用量（50、60、70、80、100 mL）、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）和提取方法（回流法、超声法）进行考察，结果表明，采用70%甲醇80 mL，回流2 h，为最佳提取方法。

狭山野豌豆、山野豌豆、假香野豌豆、广布野豌豆、毛山野豌豆和黑龙江野豌豆为同科同属植物，其鉴别和分类主要依赖于植物地上部形态特征，缺乏从实验数据中获取分类依据的方法。由于市场上药用狭山野豌豆居多，本实验建立了10批狭山野豌豆的UPLC指纹特征图谱，采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004版（A）对不同产地狭山野豌豆的UPLC指纹图谱进行相似度评价，确定了14个共有峰，首次采用UPLC/Q-TOF-MS对其中的6个共有峰进行了指认，并与透骨草药材其他5种来源品种进行UPLC图谱特征比较，有效地区分了狭山野豌豆、山野豌豆、假香野豌豆、广布野豌豆、毛山野豌豆和黑龙江野豌豆，对透骨草药材真伪、产地和品质的鉴别及质量控制研究具有重要意义，实验中发现透骨草药材与同属不同品种在化学组成和组分的相对量上存在差异，对于透骨草药材临床药理作用需要进一步实验研究。