创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是临床上常见的多发性疾病，尽管在脑损伤的诊治及相关基础研究方面取得了许多进展，但其致死率和致残率依然高居身体各部位损伤之首^[1]。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是从茶叶的有效成分茶多酚中分离出的单体化合物，药理学研究表明^{[2, 3]}，EGCG对TBI具有保护作用。

血脑屏障（blood brain barrier，BBB）是在脑和脊髓内的毛细血管与神经组织之间存在的一个调节界面。由于BBB的存在，100%的大分子药物和98%的小分子药物不能透过BBB^[4]。因此寻找克服BBB或促进药物透过BBB的方法成为增进脑部疾病治疗的关键。鼻黏膜在解剖生理上与脑部存在着独特的天然联系，部分药物经鼻腔给药后可以绕过BBB由嗅区吸收进入脑脊液，进入中枢神经系统，从而起到脑靶向作用，提高药物治疗效果。由于鼻腔黏膜带负电，因此带正电荷的药物或药物载体容易通过鼻黏膜吸收^{[5, 6, 7]}。

壳聚糖（chitosan，CS）是甲壳素（chitin）脱乙酰基后的产物，是一种天然的带正电荷高分子聚合物，具有许多独特的物理化学特性、良好的生物相容性和生物降解性，已成为药物传递系统研究的热点和重点^{[8, 9, 10, 11, 12]}。为了使EGCG透过BBB发挥药效，本研究以CS作为载体材料，采用离子凝胶化法^[13]制备EGCG-CS纳米粒（EGCG-CS-NPs），并以粒径分布和包封率为评价指标，利用Box-Behnken设计-效应面法（BBD-RSM）优化EGCG-CS-NPs处方。通过对处方的优化，制备得到均匀圆整、释药缓慢的EGCG-CS-NPs，为进一步考察EGCG-CS- NPs在体内药动学行为奠定了基础。

1200型高效液相色谱系统，美国安捷伦科技公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪予华仪器厂；RC-806溶出试验仪，天津天大天发科技有限公司；BP200型电子天平，德国赛多利斯集团公司；JEM-1200EX型透射电子显微镜，日本JEOL公司；ZetaSizer 2000HS激光粒度测定仪，英国Malvern公司；TGL-16G型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；10K超滤离心管，美国Milipore公司；透析袋，截留相对分子质量（M_W）14 000，斯百全化学上海有限公司。

CS，脱乙酰度为95%，M_W：120 000～140 000、67 000～72 000、22 000～26 000，浙江玉环海洋生物化学有限公司；EGCG对照品，上海友思生物技术有限公司，批号130414，质量分数＞99.5%；三聚磷酸钠（TPP），Sigma试剂公司；EGCG原料药，Sigma试剂公司，批号639218，质量分数＞98.5%；冰醋酸，天津市博迪化工有限公司。

采用离子凝胶化法^[13]制备EGCG-CS-NPs。取处方量的CS加入到20 mL醋酸溶液（pH 4.5）中，室温条件下搅拌溶解；称取处方量的EGCG加入到上述溶液中，室温条件下搅拌溶解；在高速（3 500 r/min）磁力搅拌下，以一定的滴定速度，用注射器缓慢加入处方量的TPP溶液（1 g/L），室温条件下搅拌60 min，将EGCG-CS-NPs溶液用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

空白CS-NPs制备参照EGCG-CS-NPs的制备方法，即：取处方量的CS加入到20 mL醋酸溶液（pH 4.5）中，室温条件下搅拌溶解，在高速（3 500 r/min）磁力搅拌下，以一定的滴定速度，用注射器缓慢加入处方量的TPP溶液（1 g/L），室温条件下搅拌60 min，将空白CS-NPs溶液用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

色谱柱为Agilent Zorbax SB- C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为1.0%醋酸水溶液-乙腈（13∶87），pH调为3.5；体积流量1.0 mL/min；检测波长280 nm；柱温25 ℃；进样量20 μL。

称取EGCG对照品10.0 mg，置50 mL量瓶中，加入流动相超声溶解，放冷至室温，作对照品贮备液（EGCG 200 μg/mL）。精密量取对照品贮备液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，置于25 mL量瓶中，以流动相稀释成4.0、8.0、20.0、40.0、80 μg/mL的对照品溶液，摇匀，微孔滤膜滤过，精密吸取20 μL，按“2.2.1”项色谱条件测定。以EGCG质量浓度（C）对峰面积（A）作线性回归，得回归方程为A＝18 165 C－8 454，r＝0.999 9。由结果可知，EGCG在4.0～80.0 μg/mL药物质量浓度与峰面积线性关系良好。方法学考察表明，在本色谱条件下辅料对EGCG的测定无干扰，日内、日间精密度分别为RSD 1.83%（n＝6）、1.51%（n＝6），低、中、高（8.0、20.0、40.0 μg/mL）3个质量浓度的平均回收率为98.4%，RSD 1.88%（n＝9）。

取1.0 mL EGCG-CS-NPs溶液置于超滤离心管（截留M_W 10 000）上端，5 000 r/min离心10 min，收集所有滤液至10 mL量瓶中，加入流动相，定容得溶液A；另取1.0 mL EGCG-CS-NPs溶液，加入1%的醋酸溶液，超声破坏10 min，定容得溶液B。分别取溶液A及溶液B的续滤液（过微孔滤膜），按照“2.2.1”项下色谱条件分别测得EGCG-CS-NPs溶液中未被包封的EGCG质量（W_游离）和EGCG-CS- NPs溶液中EGCG的总质量（W_总），计算包封率（包封率＝1－W_游离/W_总）。

离子凝胶化法制备CS-NPs的原理为CS分子中带正电的氨基与TPP分子中带负电的磷酸基之间的静电作用，二者质量浓度不同会对NPs的形成有较大影响。因此需要考察不同质量浓度下CS、TPP和EGCG交联形成NPs的情况，据此得出较佳的质量浓度范围。

CS作为药物载体具有生物相容性好、体内易降解和毒性低等特点，在新型给药系统中得到广泛应用。根据预试验结果发现CS M_W对CS-NPs的制备成型性有较大影响，因此，本研究首先应确定CS的M_W范围，分别选择120 000～140 000、67 000～72 000、22 000～26 000 3个M_W范围的CS，按照“2.1”项下方法制备空白CS-NPs，考察不同M_W的CS对NPs成型性的影响，结果见表 1。结果表明，TPP质量浓度在0.5～5.0 g/L，M_W为22 000～26 000的CS质量浓度在1.0～2.5 g/L可以形成NPs；高M_W的CS在上述质量浓度范围内形成的NPs区域较为狭窄，因此，本研究确定采用M_W为22 000～26 000的CS作为制备EGCG-CS-NPs的载体。

表 1 (Table 1)

表 1 CS MW筛选 Table 1 Screening of CS MW CS MW CS质量浓 度/(g∙L−1) TPP质量浓度/(g∙L−1) 0.1 0.5 1.0 5.0 120 000～140 000 1.0 溶液 沉淀 NPs 沉淀 2.5 溶液 溶液 沉淀 沉淀 5.0 溶液 溶液 沉淀 沉淀 67 000～72 000 1.0 溶液 NPs NPs NPs 2.5 溶液 溶液 NPs NPs 5.0 溶液 溶液 NPs 沉淀 22 000～26 000 1.0 溶液 NPs NPs NPs 2.5 溶液 NPs NPs NPs 5.0 溶液 溶液 NPs NPs

表 1 CS MW筛选 Table 1 Screening of CS MW

在预试验的基础上初步得到EGCG-CS-NPs处方的比例范围。固定处方中EGCG质量浓度为2.0 g/L，TPP质量浓度为1.0 g/L，按照“2.1”项下方法制备CS（M_W 22 000～26 000）质量浓度分别为0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、7.50 g/L的EGCG-CS-NPs。以CS-NPs的平均粒径、多分散指数（PDI）、Zeta电位、包封率为评价指标，筛选出合适的CS质量浓度，结果见表 2。结果表明，在固定EGCG和TPP质量浓度条件下，CS质量浓度对NPs的平均粒径和包封率有很大的影响。CS质量浓度在较低的条件下，相对过量的TPP可引发CS团聚成较大的颗粒而沉淀下来；随着CS质量浓度的增加，质量浓度在1.0～5.0 g/L，NPs的形成越来越容易，逐渐出现乳光，且随着CS质量浓度的增加平均粒径增大；但CS质量浓度增加到一定程度时，溶液中TPP量不足，难以与CS交联成NPs，为澄清状态。综合考虑选取CS质量浓度在1.0～5.0 g/L作进一步研究。

表 2 (Table 2)

表 2 CS质量浓度筛选 Table 2 Screening of CS concentration CS质量浓度/(g∙L−1) 外观 平均粒径/nm PDI Zeta电位/mV 包封率/% 0.25 沉淀 未测定 未测定 未测定 未测定 0.50 沉淀 未测定 未测定 未测定 未测定 1.00 NPs 81.5±23.1 0.151±0.025 27.2±3.4 73.2±5.3 2.50 NPs 127.1±32.5 0.191±0.037 26.9±4.1 83.1±4.3 5.00 NPs 384.3±62.6 0.361±0.047 23.1±4.1 87.8±6.1 7.50 溶液 未测定 未测定 未测定 未测定

表 2 CS质量浓度筛选 Table 2 Screening of CS concentration

固定处方中EGCG质量浓度为2.0 g/L，CS质量浓度为2.5 g/L，TPP质量浓度分别选择0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L作为离子交联剂，按照“2.1”项下方法制备EGCG-CS-NPs。以CS-NPs的平均粒径、PDI、Zeta电位、包封率为评价指标，筛选出合适的TPP质量浓度，结果见表 3。结果表明，在固定CS和EGCG质量浓度条件下，TPP质量浓度对NPs的平均粒径和包封率有很大的影响。TPP在质量浓度较低的条件下，CS相对过量，形成的NPs粒径较小，药物包封率也较低；TPP在质量浓度较高时，形成的NPs粒径较大。综合考虑选取TPP质量浓度在1.0～4.0 g/L作进一步研究。

表 3 (Table 3)

表 3 TPP质量浓度筛选 Table 3 Screening of TPP concentration TPP质量浓度/(g∙L−1) 外观 平均粒径/nm PDI Zeta电位/mV 包封率/% 0.5 NPs 86.4±25.7 0.168±0.031 25.1±4.7 77.1±4.7 1.0 NPs 127.1±32.5 0.191±0.037 26.9±4.1 83.1±4.3 2.0 NPs 156.7±47.4 0.201±0.041 28.1±5.2 83.1±4.3 3.0 NPs 219.4±32.5 0.252±0.063 25.9±6.4 83.6±3.2 4.0 NPs 247.1±37.1 0.235±0.041 25.2±5.9 84.1±4.8 5.0 NPs 424.1±77.4 0.271±0.047 23.1±4.1 86.1±5.2

表 3 TPP质量浓度筛选 Table 3 Screening of TPP concentration

固定处方中CS质量浓度为2.5 g/L，TPP质量浓度为1.0 g/L，分别以EGCG质量浓度为1.0、2.0、4.0、6.0 g/L投药，按照“2.1”项下方法制备EGCG-CS- NPs。以CS-NPs的平均粒径、包封率为评价指标，考察EGCG质量浓度对NPs性质的影响，结果见表 4。结果表明，在固定CS和TPP质量浓度条件下，EGCG质量浓度变化对NPs的平均粒径影响不大，但对包封率有很大的影响。随着EGCG质量浓度的增加，CS-NPs的包封率呈下降趋势，这是由于EGCG为水溶性药物，当EGCG质量浓度增加时，CS-NPs不能对其有效地吸附和包裹，EGCG以游离状态的数量增加所致。综合考虑选取EGCG质量浓度在1.0～4.0 g/L作进一步研究。

表 4 (Table 4)

表 4 EGCG质量浓度筛选 Table 4 Screening of EGCG concentration EGCG质量浓度/(g∙L−1) 外观 平均粒径/nm 包封率/% 1.0 NPs 112.3±36.2 87.4±3.9 2.0 NPs 121.4±39.7 85.2±4.5 4.0 NPs 114.2±40.0 76.6±3.2 6.0 NPs 132.8±36.8 67.3±3.6

表 4 EGCG质量浓度筛选 Table 4 Screening of EGCG concentration

单因素考察结果表明，采用离子凝胶化法制备EGCG-CS-NPs的过程中，CS、TPP和EGCG质量浓度对EGCG-CS-NPs的性质都有显著影响。因此，采用CS质量浓度在1.0～5.0 g/L，TPP质量浓度在1.0～4.0 g/L，EGCG质量浓度在1.0～4.0 g/L，应用Box-Behnken效应面法进一步优化处方。

通过处方单因素考察，选取对EGCG-CS-NPs性质影响较显著的3个因素：CS质量浓度（X₁）、TPP质量浓度（X₂）、EGCG质量浓度（X₃）为考察对象，以包封率（Y₁，%）、平均粒径（Y₂，nm）为评价指标，利用BBD-RSM优化EGCG-CS-NPs处方。因素水平见表 5，处方优化试验安排及结果见表 5。

表 5 (Table 5)

表 5 BBD-RSM试验设计与结果 Table 5 Design and results of BBD-RSM test 试验号 X1/(g∙L−1) X2/(g∙L−1) X3/(g∙L−1) Y1/% Y2/nm 试验号 X1/(g∙L−1) X2/(g∙L−1) X3/(g∙L−1) Y1/% Y2/nm 1 1 (−1) 4 (+1) 2.5 (0) 69.2 88.6 9 1 (−1) 1 (−1) 2.5 (0) 83.2 104.2 2 3 (0) 1 (−1) 1 (−1) 87.6 254.7 10 3 (0) 1 (−1) 4 (+1) 87.2 264.1 3 3 (0) 4 (+1) 4 (+1) 75.4 159.1 11 5 (+1) 1 (−1) 2.5 (0) 87.6 547.8 4 5 (+1) 2.5 (0) 1 (−1) 90.1 564.3 12 1 (−1) 2.5 (0) 1 (−1) 78.6 95.4 5 3 (0) 4 (+1) 1 (−1) 85.5 161.3 13 1 (−1) 2.5 (0) 4 (+1) 67.3 101.1 6 3 (0) 2.5 (0) 2.5 (0) 88.4 117.4 14 5 (+1) 4 (+1) 2.5 (0) 84.5 346.9 7 5 (+1) 2.5 (0) 4 (+1) 86.2 483.7 15 3 (0) 2.5 (0) 2.5 (0) 87.9 116.2 8 3 (0) 2.5 (0) 2.5 (0) 90.6 141.7

表 5 BBD-RSM试验设计与结果 Table 5 Design and results of BBD-RSM test

采用Design expert 7.0实验设计软件，对EGCG-CS-NPs处方优化所得数据进行处理，以评价指标（因变量）分别对各因素（自变量）进行多元二项式方程拟合。对二项式方程中的各项系数进行F检验，所得结果见表 6、7。

表 6 (Table 6)

表 6 Y1的多元二项式方程中的各项系数 Table 6 Each regression coefficient of polynomial functions of Y1 因素 平方和 df F值 P值 因素 平方和 df F值 P值 因素 平方和 df F值 P值 模型 730.42 9 18.05 0.002 7** X1X3 13.69 1 3.05 0.141 4 残差 22.48 5 X1 313.75 1 69.79 0.000 4** X2X3 23.52 1 5.23 0.070 9 失拟项 45.72 3 2.96 0.262 3 X2 120.13 1 26.72 0.003 6** X12 116.14 1 25.83 0.003 8** 纯误差 25.91 2 X3 82.56 1 18.36 0.007 8** X22 18.42 1 4.10 0.098 9 R2＝0.970 1 X1X2 29.70 1 6.61 0.049 0* X32 29.12 1 6.48 0.051 6 *表示显著性（P＜0.05）；**表示极显著性（P＜0.01），表 7同 *indicates a significant (P < 0.05); **indicates very significant (P < 0.01),same as Table 7

表 6 Y1的多元二项式方程中的各项系数 Table 6 Each regression coefficient of polynomial functions of Y1

表 7 (Table 7)

表 7 Y2的多元二项式方程中的各项系数 Table 7 Each regression coefficient of polynomial functions of Y2 因素 平方和 df F值 P值 因素 平方和 df F值 P值 因素 平方和 df F值 P值 模型 4.016×105 9 54.48 0.000 2** X1X3 1 861.92 1 2.27 0.192 0 残差 4 095.08 5 X1 3.016×105 1 368.28 ＜0.000 1** X2X3 33.64 1 0.041 0.847 4 失拟项 3 681.02 3 5.93 0.147 8 X2 21 517.75 1 26.27 0.003 7** X12 56 818.72 1 69.37 0.000 4** 纯误差 414.06 2 X3 572.91 1 0.70 0.441 1 X22 1 906.80 1 2.33 0.187 6 R2＝0.989 9 X1X2 8 584.02 1 10.48 0.023 0* X32 14 181.79 1 17.32 0.008 8**

表 7 Y2的多元二项式方程中的各项系数 Table 7 Each regression coefficient of polynomial functions of Y2

由表 6中数据结果可知R²＝0.970 1（P＜0.05），说明Y₁采用多元二项式方程拟合是适合的。方程中X₁、X₂、X₃、X₁X₂、X₁²对Y₁影响较显著。在EGCG质量浓度固定时，Y₁随着CS质量浓度的增加而增大，随着TPP质量浓度的增加而减小（图 1-A）；在TPP质量浓度固定时，Y₁随着CS质量浓度的增加而增大，随着EGCG质量浓度的增加而减小（图 1-B）；在CS质量浓度固定时，Y₁随着TPP和EGCG质量浓度的增加而降低（图 1-C）。

图 1

Fig. 1

图 1 自变量X1、X2、X3与因变量Y1的3D效应面图 Fig. 1 Response surface plots (3D) of effects of X1,X2,and X3 on Y1

由表 7中数据结果可知R²＝0.989 9（P＜0.05），说明Y₂结果采用多元二项式方程拟合是适合的。方程中X₁、X₂、X₁X₂、X₁²、X₃²对Y₂影响较显著（P＜0.05、0.01）。在EGCG质量浓度固定时，Y₂随着CS质量浓度的增加而增大，随着TPP质量浓度的增加而增大（图 2-A）；在TPP质量浓度固定时，Y₂随着CS质量浓度的增加而增大，随着EGCG质量浓度的增加先降低后增大（图 2-B）；在CS质量浓度固定时，Y₂随着TPP质量浓度的增加而减小，随着EGCG质量浓度的增加先降低后增大（图 2-C）。

图 2

Fig. 2

图 2 自变量X1、X2、X3与因变量Y2的3D效应面图 Fig. 2 Response surface plots (3D) of effects of X1,X2 and X3 on Y2

根据Design expert 7.0实验设计软件得EGCG-CS-NPs最优处方：CS质量浓度为2.6 g/L、TPP质量浓度为1.5 g/L、EGCG质量浓度为2.7 g/L。以优化的最优处方按照“2.1”项下方法制备3批EGCG-CS-NPs，按照“2.3”和“2.6”项下方法测定EGCG-CS-NPs Y₁和Y₂，实验观察值与模型预测值见表 8，可知，实验观察值和模型预测值比较接近，说明模型预测性良好。

表 8 (Table 8)

表 8 EGCG-CS-NPs各指标预测值和观察值 Table 8 Predicted and observed response values for each indicator 优化指标 预测值 观察值 偏差/% Y1/% 88.9 85.8±3.1 −3.5 Y2/nm 106.8 102.2±27.1 4.5 偏差＝(观察值－预测值)/预测值 deviation = (observed value－predicted value)/predictive value

表 8 EGCG-CS-NPs各指标预测值和观察值 Table 8 Predicted and observed response values for each indicator

取EGCG-CS-NPs溶液适量，用蒸馏水稀释适量倍数，采用ZetaSizer 3000HS激光粒度测定仪测定EGCG-CS-NPs的粒径分布和Zeta电位，结果见图 3。EGCG-CS-NPs的平均粒径为（102.2±27.1）nm，PDI为0.193±0.019，Zeta电位为（25.5±4.1）mV。

图 3

Fig. 3

图 3 EGCG-CS-NPs粒径分布和Zeta电位 Fig. 3 Particle size distribution and Zeta potential of EGCG-CS-NPs

取适量EGCG-CS-NPs滴在喷碳铜网表面，使液体尽量铺满整个铜网，加入重蒸馏水稀释适当倍数，保持15 min，用滤纸吸除大部分水分，滴加2.0%的磷钨酸水溶液，染色5 min，用滤纸吸去水分，将铜网取出，待干后用透射电镜观察EGCG-CS-NPs的形态结构。由图 4可见，EGCG-CS-NPs呈球形。

图 4

Fig. 4

图 4 EGCG-CS-NPs透射电镜图 Fig. 4 TEM photogram of EGCG-CS-NPs

采用透析法考察EGCG-CS-NPs在体外PBS（pH 4.5）中的释放行为。精密吸取2.0 mL EGCG- CS-NPs 3份，分别置于处理好的透析袋（截留M_W 14 000）内，扎紧后置于溶出仪的桨叶底部。分别移取100 mL释放介质放入250 mL溶出杯中。恒温（32.0±0.5）℃，转速50 r/min，分别于0.25、0.5、0.75、l、2、4、6、8、12、16、24 h吸取1 mL释放介质（同时补加等量、同温的释放介质）。取出的释放介质用0.22 μm微孔滤膜滤过，按照“2.2.1”项下色谱条件测定EGCG的量。另取2 mL EGCG溶液置于透析袋内，同上进行释放试验，计算EGCG的累积释放率，结果见图 5。体外释放研究结果表明，EGCG溶液在1.0 h内基本释放完全；而EGCG-CS-NPs在释放初期有药物突释现象，这是可能由于EGCG-CS-NPs中的游离药物以及吸附在NPs表面的药物释放所致，随后药物释放较为缓慢，24 h累积释放率为（90.4±4.6）%，表明EGCG- CS-NPs有延缓药物释放的作用。

图 5

Fig. 5

图 5 EGCG-CS-NPs与EGCG溶液体外释放曲线 Fig. 5 Release profile in vitro of EGCG-CS-NPs and EGCG solution

鼻腔黏膜按照功能分为呼吸区和嗅觉区，其中嗅觉区仅仅占总面积的5%，但是嗅觉区却提供了从鼻腔入脑的一个直接通路^[14]。由于鼻腔黏膜带负电，因此带正电荷的药物或药物载体容易通过鼻黏膜吸收。EGCG-CS-NPs表面带正电荷，因此能与鼻黏膜上皮细胞形成共价键结合，抵抗黏膜纤毛对药物的清除，保证药物的跨细胞膜传递；同时，CS能可逆性的、暂时性打开上皮细胞之间的紧密连接，增强黏膜对药物的吸收作用^[15]，从而实现药物的脑靶向性。

CS-NPs的制备方法有：复凝聚法^[16]、共价交联法^[17]、离子凝胶化法^[13]、乳滴聚结法^[18]等。离子凝胶化法是目前文献报道较多的制备载药CS-NPs的方法，其原理是利用CS分子中带正电的氨基与生物相容性较好的TPP分子中带负电的磷酸基之间的静电作用，并在外力作用下形成NPs。在磁力搅拌条件下，将TPP溶液缓慢滴加到pH值4～6的CS溶液中，通过磷酸根负离子与CS分子链上带正电的质子化氨基发生分子内和分子间交联凝胶化，便可迅速生成NPs。由于该实验条件温和，操作方便，不使用有机溶剂，因此在CS-NPs的制备中得到广泛的应用。