蒙药文冠木Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium为无患子科（Sapindaceae）文冠果属Xanthoceras Bunge植物文冠果Xanthoceras sorbifolium Bunge的茎杆或枝条的干燥木部。蒙医理论认为该药具有燥“协日乌素”、清热、消肿、止痛的作用，用于游痛症、痛风症、热性“协日乌素”病、青腿病、皮肤瘙痒、脱发、黄水疮、风湿性心脏病、关节疼痛、淋巴结肿大、浊热的治疗^{[1, 2]}。蒙药复方森登-4是由文冠木、栀子、川楝子、诃子共研细末而后制成汤剂，方中文冠木能够燥黄水、消肿止痛，为君药；川楝子清热、燥黄水，为臣药；栀子清血热，为佐药；诃子解毒、调理体素，为使药。本方具有清热、燥黄水、消肿功能，主治痛风、痹病、关节黄水病和水肿^[3]。

目前，组学方法已被广泛应用于药物的指纹图谱鉴定^[4]、药物炮制^{[5, 6, 7]}、药物代谢^{[8, 9, 10]}等方面的研究，而多元线性回归分析法已被应用于复方森登-4的药效物质基础研究^{[11, 12]}，但文冠木配伍产生复方森登-4的机制研究未见报道。为进一步研究文冠木的配伍机制，本实验采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）技术结合化学计量学方法，利用主成分分析（PCA）对文冠木与复方森登-4的轮廓进行区分、利用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）寻找文冠木与复方森登-4间的化学标记物，用于揭示文冠木配伍生成复方森登-4后抗炎及抗风湿活性增强的原因。

Waters超高效液相色谱仪，Waters Xevo G-2S QTOF质谱仪，Waters，UK；F-54BW型pH计，HORIBA，Japan。甲醇、甲酸为色谱纯试剂，美国Fisher公司；提取用乙醇为分析纯，北京化工厂；水为超纯水（18.2 MΩ∙cm）。

文冠木为无患子科植物文冠果Xanthoceras sorbifolia Bunge的干燥茎干，购于安国市健仁药材有限公司；栀子为茜草科栀子属植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的果实，购于亳州市药州商行；川楝子为楝科楝属植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果实，购于亳州市中正中药材饮片有限公司；诃子为使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz. 的干燥成熟果实，购于安国市京源中药饮片有限公司；所有中药饮片均由内蒙古民族大学化学化工学院从事天然产物研究工作的包玉敏教授进行鉴定。

对照品槲皮素（批号100081-201509）、芦丁（批号100080-201409）、儿茶素（批号110877-201203）、没食子儿茶素（批号111987-201501）、双氢杨梅素（批号110878-201102）购于成都曼斯特生物科技有限公司，所有对照品质量分数均≥98%。

色谱柱为Waters Acquity BEH- C₁₈柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温40 ℃；流动相为0.1%甲酸水溶液-甲醇，二元线性梯度洗脱：0～8 min，1%～80%甲醇；8～12 min，80%～100%甲醇；12～14 min，100%甲醇；14～15 min，100%～1%甲醇；15～17 min，1%甲醇；体积流量0.4 mL/min；进样量10 μL。

ESI离子源，采用正离子模式，扫描范围：m/z 100～1 000，毛细管电压3 000 V，锥孔电压40 V，离子源温度100 ℃，雾化温度400 ℃，壳气体积流量800 L/h。质谱以亮氨酸脑啡肽做内标，甲酸钠校正质量轴。

所有UPLC-MS数据均使用Masslynx V4.1软件进行峰提取、峰对齐及归一化处理，用EZinfo 2.0软件进行PCA、OPLS-DA分析。

取文冠木药材粉末1.5 g，精密称定，以95%乙醇15 mL为溶剂，水浴回流提取2次，每次2 h，减压抽滤，合并2次提取液，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2 mL甲醇溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，待测。

分别称取1.5 g文冠木、0.9 g川楝子、0.3 g栀子、0.3 g诃子，将4种粉末混合，以95%乙醇30 mL为溶剂，水浴回流提取2次，每次2 h，减压抽滤，合并2次提取液，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2 mL甲醇溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，待测。

蒙药文冠木、复方森登-4（文冠木、川楝子、栀子、诃子共煎液）的基峰色谱图见图 1。由图可见，文冠木配伍后儿茶素的溶出量明显下降，没食子儿茶素、双氢杨梅素所代表的色谱峰消失，而芦丁的溶出量略有升高。文冠木配伍过程中，由于其它单味药含有复杂的化学成分，如甘草中含有大量的甘草酸、甘草次酸等物质^[13]，致使共煎液的pH值相对于文冠木单煎液发生了变化（文冠木单煎液与复方森登-4溶液的pH值分别为6.2、5.4），文冠木中的黄酮类成分在此pH值条件下不稳定，容易与其他成分发生反应，因而导致其溶出量下降；有研究表明^[14]，当pH值在4～6时，药材中芦丁的量比较稳定，而当pH＜4或pH＞6时，芦丁的量急剧减少，因此配伍后pH值为5.4的条件可能有利于芦丁的溶出；另一方面，川楝子中同样含有一定量的芦丁^[15]，因此，文冠木经配伍后芦丁的溶出量反而升高。

图 1

Fig. 1

图 1 文冠木与复方森登-4的基峰离子色谱图 Fig. 1 Base peak ion chromatograms of Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus etFolium and Sendeng-4

无监督的模式识别方法——PCA分析可以反映数据的原始状态，直观地显示不同样品间的整体差异，故首先对文冠木与复方森登-4样品进行PCA分析，结果见图 2。从图 2-A可以看出，文冠木与复方森登-4样品可明显区分，这说明文冠木配伍后某些化学成分的相对质量分数发生了明显变化，模型质量评价指标分别为R_X^2[1]＝0.502 5，R_X^2[2]＝0.317 4，表明模型大致能够反映84%的变量信息，模型质量良好。

图 2

Fig. 2

图 2 文冠木 (■) 与复方森登-4 (▲) 的PCA (A) 和OPLS-DA (B) 得分图 Fig. 2 PCA (A) and OPLS-DA (B) score plot of Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus etFolium (■) and Sendeng-4 (▲)

为了找到引起文冠木配伍变化的化学标记物，需要利用有监督的识别模式——OPLS-DA分析。有监督的模式识别方法可以扩大组间差异，但需要利用外部模型验证方法排列实验来证明模型的有效性。从图 2-B可以看出，在OPLS-DA得分图中文冠木与森登-4依然可以被明显区分，而模型质量评价指标分别为R_Y²＝0.835 8，Q²＝0.815 0。

为进一步确定配伍后各成分变化情况，采用OPLS-DA对文冠木、复方森登-4进行了分析，得到了S-Plot图（图 3-A）以及VIP图（图 3-B）。在图 3-A中，“S”曲线中的每1个点代表 1个变量，变量对分类的重要程度由VIP值的大小来衡量，变量离原点越远，VIP值越大。根据图 3-B中的VIP值对变量进行筛选，取VIP＞1.0的物质作为化学标记物。通过与对照品比对、高分辨质谱数据及文献报道资料对化学标记物进行鉴定，共得到8种化学标记物（P＜0.05），分别为儿茶素（1）、没食子儿茶素（2）、双氢杨梅素（3）、槲皮素（4）、xanthocerasic acid（5）、3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid（6）、3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic acid（7）、芦丁（8）。文冠木与复方森登-4的化学标记物推断结果见表 1。

图 3

Fig. 3

图 3 文冠木与复方森登-4的OPLS-DA S-Plot (A) 与VIP图 (B) Fig. 3 OPLS-DA S-Plot (A) and VIP (B) of Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium and Sendeng-4

表 1 (Table 1)

表 1 文冠木与复方森登-4中化学标记物的数据 Table 1 Data of chemical markers of Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium and Sendeng-4 序号 保留时间/min 测量值 (m/z) 理论值 (m/z) 偏差/×10−6 分子式 趋势* 化合物 1 2.72 291.086 8 291.086 3 1.8 C15H15O6 ↓ 儿茶素 2 2.03 307.081 1 307.081 2 0.3 C15H15O7 ↓ 没食子儿茶素 3 2.46 321.060 8 321.060 5 1.0 C15H13O8 ↓ 双氢杨梅素 4 9.23 471.348 7 471.349 6 2.0 C30H47O4 ↑ xanthocerasic acid 5 4.00 303.049 3 303.049 9 2.1 C15H11O7 ↓ 槲皮素 6 9.83 457.367 1 457.367 6 1.2 C30H49O3 ↑ 3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid 7 10.54 455.351 6 455.352 0 0.9 C30H47O3 ↑ 3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic acid 8 11.98 611.160 2 611.160 7 0.9 C27H31O16 ↑ 芦丁 *复方森登-4相对于文冠木的量，↓下降，↑上升 *content of Sendeng-4 related to Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium,↓decrease,↑increase

表 1 文冠木与复方森登-4中化学标记物的数据 Table 1 Data of chemical markers of Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium and Sendeng-4

利用Masslynx V4.1软件对UPLC-MS数据进行处理，得到了文冠木与复方森登-4中所有化学标记物的相对质量分数，从图 4中可以看到，儿茶素、没食子儿茶素、双氢杨梅素、槲皮素的相对质量分数下降，而xanthocerasic acid、3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid、3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic acid、芦丁的相对质量分数升高。

图 4

Fig. 4

图 4 文冠木与复方森登-4间化学标记物的相对质量分数变化图 Fig. 4 Relative content changes of chemical marker between Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium and Sendeng-4

本实验采用UPLC-MS技术与化学计量学相结合的方法研究蒙药复方森登-4配伍前后其君药文冠木的主要化学成分的变化情况。复方森登-4配伍后，文冠木中3种成分xanthocerasic acid、3β- hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid、3-oxotirucalla- 7,24-dien-21-oic acid的量增加，已有的研究表明，这3种成分具有显著抑制HIV病毒的活性^[16]，因此，文冠木配伍组成森登-4之后其抗HIV病毒的活性可能增强；文献报道^{[17, 18]}芦丁经大鼠ip，对植入羊毛球的发炎过程有明显的抑制作用，芦丁的硫酸酯钠对大鼠热浮肿同样有很强的抗炎作用，而本实验结果显示，文冠木配伍后其抗炎镇痛指标成分芦丁的量明显增加，因此，本实验结果在一定程度上阐释了蒙药复方森登-4配伍的科学原理，即蒙药复方配伍后其中一些活性指标成分的量增加导致了药效的增强。