灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand. -Mazz. 为忍冬科植物。干燥花蕾或带初开的花为中药^[1]，具有清热解毒，凉散风热的功效，临床上广泛用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病等症，也可作为提取绿原酸或挥发油的原料，长期以来如何解决灰毡毛忍冬蕾期短、采摘不及时是灰毡毛忍冬生产和应用中一个棘手的问题。常规品种的灰毡毛忍冬花蕾期长仅3～4 d，开花后第2天即开始凋谢^[2]，采收时间仓促，有时与农时相冲突来不及采摘，直接影响灰毡毛忍冬药材的产量与质量。杨苗等^[3]和耿世磊等^[4]对灰毡毛忍冬不同发育阶段花结构与绿原酸量变化关系进行了研究，结果表明花中细胞分化较早绿原酸量较高，分化越成熟量越低。以上说明，灰毡毛忍冬绿原酸的富集在蕾期较多，其量随着花冠展开而下降。花期太短不仅对采摘灰毡毛忍冬药材带来麻烦，还将直接影响灰毡毛忍冬的产量和品质。因此，灰毡毛忍冬蕾期长短是生产中亟待解决的关键瓶颈问题。

20世纪90年代末，发现了一株灰毡毛忍冬自然变异株，表现为花蕾整齐，花蕾期长，花冠不开放，花蕾初期呈青绿色，逐渐转为绿白色和白色，20多天才开始凋谢等性状。该变异性状为灰毡毛忍冬的采摘、质量及农事操作等提供了有力的保障，于2004年6月通过省级鉴定，命名为湘蕾灰毡毛忍冬，被广泛引种栽培。湘蕾灰毡毛忍冬具有以上诸多优点，为灰毡毛忍冬的开发利用开创了新的纪元，也因此促使了诸多研究学者对变异株变异的根本原因进行探索，期望能找到调控优良性状的原因，为其他花类药材、食品、切花等领域指引新的方向。

目前大量不同植物种类的MADS家族基因已经被成功克隆，MADS-box基因是真核生物中一类重要的转录调控因子，在生长发育调控和信号传导中发挥着重要作用，同时在植物中参与花器官的发育，开花时间的调节，但灰毡毛忍冬MADS-box相关基因的研究并不多^[5]。因此，研究灰毡毛忍冬MADS-box家族基因对于阐明灰毡毛忍冬蕾期控制相关分子机制有重要意义^[6]。

本课题组前期对常规灰毡毛忍冬和湘蕾灰毡毛忍冬转录组进行了测序和分析，获得多条差异明显基因，同时有数条预测为有控制发育功能的编码序列（coding sequence，CDS）的MADS-box家族成员，其中Unigene17356基因差异明显，根据其序列设计引物，对湘蕾型灰毡毛忍冬总RNA 进行逆转录（reverse transcription）反应和cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE），获得完整的开放阅读框（ORF），并命名为Lm-AGL15，首次成功从灰毡毛忍冬总RNA中克隆到可能参与控制蕾期延长的基因AGL15。运用生物信息学的方法对该序列进行同源性分析，理化性质分析，并预测Lm-AGL15编码蛋白。最后通过半定量PCR技术对Lm-AGL15基因在灰毡毛忍冬不同部位的表达进行差异对比分析，为后续进一步通过功能分析找出控制湘蕾灰毡毛忍冬花蕾期长度、抑制花冠展开的系列功能基因，为将来进一步通过转基因技术将这些功能基因转入其他品种的灰毡毛忍冬、金银花或其他药用、食用、切花、香精香料原料等植株中，培育出花蕾期长、或花冠不展开的新优良品种打下前期基础，具有广泛的开发和应用前景，有望带来巨大的社会效益和经济效益。

样品均采自湖南中医药大学药用植物培植基地，经湖南中医药大学药学院周日宝教授鉴定为湘蕾型灰毡毛忍冬与常规型灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.。立即用锡箔纸包裹置于液氮中保存。

Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）、琼脂糖凝胶回收试剂盒、Trans2K DNA Marker（全式金生物科技有限公司）；EASY-T1 Cloning试剂盒、RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit（反转录试剂盒）（北京智杰方远科技有限公司）；3’-RACE 试剂盒、5’-Full RACE Kit with TAP试剂盒、Ex TaqDNA聚合酶，Ex TaqHS DNA聚合酶（Takara公司）；其余试剂均为国产分析纯；扩增所用引物及获得片段的序列测定委托上海生工生物工程有限公司完成（表 1）。

表 1 (Table 1)

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 引物 序列 (5’-3’) 引物用途 Lm-AGL15F ATGGGTCGAGGGAAGATTGAG 核心片段上游引物 Lm-AGL15R TTAACATTTCAATTTCATTTC 核心片段下游引物 AGL15GSP1 GATTACGCCAAGCTTCAAGGCAGAGGAACCTAAGGAGGTGGAT 3’-RACE上游特异性引物 AGL15GSP2 GATTACGCCAAGCTTTCCACCTCCTTAGGTTCCTCTGCCTTGT 5’-RACE下游特异性引物

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences

参照Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书，以1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计检测RNA纯度。以提取的RNA样品为模板，使用北京智杰方远科技有限公司的反转录cDNA第一链合成试剂盒合成第一条链，获得cDNA样品于−20 ℃贮存备用^[6]。

根据前期灰毡毛忍冬转录组测序获得的长度为765 bp Unigene17356序列，设计特异性引物，上游引物Lm-AGL15F，下游引物Lm-AGL15R。以“2.1”项方法获得的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系25 μL，其中引物Lm-AGL15F和Lm-AGL15R各2.5 μL，10×Ex Taq 缓冲液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，模板cDNA 3 μL，Ex TaqDNA聚合酶1 μL，补ddH₂O 12.5 μL至25 μL。反应条件为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，34个循环后72 ℃延伸10 min。经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收核心片段，连接和转化过程参考全式金pEASY-T1 Cloning Kit试剂盒说明书，转化Trans1-T1感受态细胞。

菌液PCR体系：25 μL体系含1 μL菌液，2 μL dNTPs，1 μL Taq酶，2.5 μL 10×Buffer，引物各1 μL，17.5 μL ddH₂O。94 ℃预变性7 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环扩增34次；72 ℃延伸10 min。将PCR鉴定的阳性克隆，按质粒提取试剂盒方法提取质粒DNA，送上海生工生物工程 有限公司测序。

使用TaKaRA 3’-RACE试剂盒将灰毡毛忍冬总RNA反转录为cDNA，以AGL15GSP1进行灰毡毛忍冬3’端PCR扩增。

PCR 50 μL反应体系：2 μL反转录反应液，8 μL 1xcDNA Dilution Buffer II，2 μL AGL15GSP1（10 μmol/L），2 μL 3’-RACE Primer（10 μmol/L），5 μL10×PCR Buffer II（Mg²⁺ Free），3 μL MgCl₂（25 mmol/L），0.5 μL Taq酶（2.5 U/μL），28.5 μL ddH₂O。94 ℃、5 min，94 ℃、55 s，55 ℃、1 min，72 ℃、90 s；共32个循环；72 ℃、10 min。

PCR产物经凝胶回收、连接和转化，挑取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

使用TaKaRA 5’-RACE试剂盒将灰毡毛忍冬总RNA反转录为cDNA，以AGL15GSP2进行灰毡毛忍冬5’端PCR扩增。

PCR 50 μL反应体系：2 μL反转录反应液，9 μL 1×cDNA Dilution Buffer II，3 μL 10×PCR Buffer II（Mg²⁺ free），3 μL MgCl₂（25 mmol/L），0.5 μL Taq酶（2.5 U/μL），2 μL AGL15 GSP2 Primer（10 μmol/L），2 μL 5’-RACE Outer Primer（10 μmol/L），28.5 μL ddH₂O。94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s、55 ℃、35 s，72 ℃、90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min^{[7, 8]}。

取PCR反应液各10 μL，使用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，切胶回收电泳条带，连接、转化，挑取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

根据已测定的核心片段、5’和3’端序列及其重叠区域，使用Bioedit软件进行序列分析及拼接，获得Lm-AGL15基因cDNA全长序列。将获得的序列上传到NCBI的ORF Finder平台（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/），确定是否获得全长ORF。将确定的ORF片段上传到NCBI的CD-search（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd），对预测的

氨基酸序列进行保守区域搜索，验证该ORF片段是否完整^{[6, 7, 8, 9, 10]}。

根据全长序列，设计可扩增Lm-AGL15基因全长的特异性引物，预计扩增长度为760 bp。分别按“2.1”项方法提取RNA后反转录为cDNA。利用扩增Lm-AGL15基因，反应条件同“2.2”项。取10 μL PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳检查。

使用Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法提取同一批5份（1～5）灰毡毛忍冬总RNA，非变性琼脂糖凝胶电泳结果如图 1所示，总RNA无DNA残留和蛋白质杂质，电泳结果显示28 S、18 S条带清晰，无拖尾现象。说明RNA具有良好的完整性。紫外分光光度法测定A_{260 nm}/A_{230 nm}值在2.11，A_{260 nm}/A_{280 nm}值在2.01，说明RNA纯度高，能满足后续实验要求。

图 1

Fig. 1

图 1 灰毡毛忍冬总RNA电泳图 Fig. 1 Electrophoresis of total RNA in L. macranthoides

前期转录组测序获得长765 bp的Unigene17356序列，经BLAST分析后发现其可能为MADS-box家族基因，根据该序列设计引物，扩增出目的核心片段，PCR产物使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图 2，在750 bp左右有一条明显的亮带，扩增产物大小与预测片段大小基本相符，初判为目的基因片段。使用胶回收试剂盒回收目标片段，将回收的产物连接后转化，取阳性克隆子进行测序，测序结果显示该序列的长度为764 bp，将测序结果与NCBI数据库进行BLAST对比，该片段与数据库中葡萄Vitis vinifera L. AGL15相似性很高，相似度为80%，证明该核心片段为灰毡毛忍冬AGL15基因的核心片段。

图 2

Fig. 2

图 2 AGL15基因核心片段的PCR扩增结果 Fig. 2 PCR result of core fragment of AGL15 gene

利用合成的3’-RACE特异性引物，进行PCR扩增。3’-RACE PCR的扩增结果在800 bp有一条亮带（图 3）。将PCR产物切胶回收，连接pEASY-T1 载体后转化，取阳性克隆子进行测序。

图 3

Fig. 3

图 3 AGL15基因3’-RACE PCR结果 Fig. 3 3’-RACE PCR results of AGL15 gene

利用设计合成的5’-RACE特异性引物，进行PCR扩增。5’-RACE扩增结果在500 bp左右有一条亮带（图 4）。将PCR产物回收，连接后转化，取阳性克隆子进行测序。

图 4

Fig. 4

图 4 AGL15基因5’-RACE PCR结果 Fig. 4 5’-RACE PCR results of AGL15 gene

使用Bioedit 软件将上述测序所得到的核心目的序列与3’端、5’端序列进行拼接，得到基因全长序列，并对其验证。设计全长引物，进行PCR，回收、转化及测序，测序结果与拼接结果一致，则说明已经扩增得到灰毡毛忍冬AGL15基因的cDNA全长序列，验证后将该基因命名为Lm-AGL15基因，获得基因登录号为KR028478。

Lm-AGL15基因全长1 399 bp，不含内含子序列，编码265个氨基酸（GenBank登录号为KR028478，

结果见图 5。利用ExPASy Proteomics Server的在线软件Protparam（http://www.cn.expasy.org/tools/protparm.html）对Lm-AGL15蛋白的理化性质进行预测分析，推测其分子式为C₁₃₂₄H₂₁₆₁N₃₇₆O₄₂₀S₁₂，相对分子质量为30 493，等电点为6.39，为酸性蛋白，正电残基（Arg＋Lys）为40，负电残基（Asp＋Glu）为42。脂肪系数为85.28，其半衰期在体外哺乳动物网织红细胞为100 h，在酵母体内大于20 h，在大肠杆菌体内大于10 h。不稳定系数为52.67，为不稳定蛋白。对该氨基酸序列进行亲疏水性分析，结果如图 6所示，横坐标表示氨基酸残基的序号，纵坐标表示残基的疏水、亲水特性，正值为疏水，负值为亲水。总平均疏水指数（GRAVY）为−0.201，预测其为亲水性蛋白。通过TMHMM软件分析得知，Lm-AGL15编码蛋白质无跨膜区域，全部位于膜外。通过Target IP服务器的分析，判断Lm-AGL15蛋白定位于细胞质中。通过SMART服务器分析，Lm-AGL15蛋白第1～60位和第74～162位是2个高度保守的结构功能域——MADS和K-box，即MADS-box家族成员共有的典型结构域^[10]。

图 5

Fig. 5

图 5 Lm-AGL15基因核苷酸序列 Fig. 5 Nucleotide sequences of Lm-AGL15 gene

图 6

Fig. 6

图 6 Lm-AGL15编码蛋白的亲水性分析 Fig. 6 Hydrophily analysis on Lm-AGL15-coding protein

运用Predictprotein软件预测结果显示，软件预测Lm-AGL15蛋白的二级结构表明该蛋白含有123个α螺旋，占46.42%；17个β折叠，占6.03%；125个无规卷曲，占47.55%。SWISS-MODEL软件三级结构预测结果显示Lm-AGL15基因编码蛋白质的三级结构见图 7。

图 7

Fig. 7

图 7 灰毡毛忍冬AGL15蛋白三级结构同源建模 Fig. 7 Homologous modeling of tertiary structure of AGL15 protein in L. macranthoides

Lm-AGL15基因编码的氨基酸序列经NCBI的BLASTp分析，获得与其相似性较高的蛋白，其中与麻风树Jatropha curcas L.、葡萄AGL15基因相似性最高，达67%。使用GENEDOC软件将该氨基酸序列与比对上的前5条不同物种的蛋白质序列进行比对，结果如图 8所示，相似性由高到低分别是葡萄AGL15基因[AGL15 isoform X1，731414618]，麻风树Jatropha curcas L. AGL15基因 [AGL15，802556094]，甜橙Citrussinensis (L.) Osbeck. AGL15基因 [AGL15-like，568858840]，梅Prunus mume Apricot. AGL15基因 [AGL15，645251155]，野草莓Fragaria vesca Duch. AGL15基因 [AGL15，470143144]。分析发现Lm-AGL15基因编码的氨基酸序列具有Mads-box家族特有的MADS与K-box保守序列，可进一步确定其为MADS-box家族基因^{[11, 12, 13, 14, 15]}。

图 8

Fig. 8

图 8 Lm-AGL15 编码蛋白与其他物种AGL15基因编码蛋白的相似性分析 Fig. 8 Similarity analysis on Lm-AGL15-coding protein and other AGL15 proteins

为了分析灰毡毛忍冬Lm-AGL15基因与其他AGL15基因的进化关系，将获得的Lm-AGL15基因推导的氨基酸序列与其他植物中已报道的属于AGL15亚家族的成员进行比对，构建系统发育树状图（图 9），其中包括葡萄、龙眼Dimocarpus longan Lour.、白梨Pyrus bretschneideri Rehd.、雷蒙德式棉Gossypium raimondii Ulbr.、苹果Malus pumila Mill.、梅、麻风树、橙子以及野草莓。

图 9

Fig. 9

图 9 Lm-AGL15基因与已知的AGL15基因的进化树分析 Fig. 9 Phylogenetic tree for Lm-AGL15 and these from other species

从图 9中可以分析得出AGL15亚家族基因大致归为3类，Lm-AGL15蛋白序列与其他被子植物门双子叶植物纲的AGL15基因有较近的亲缘关系归为一类，可确定该基因编码AGL15亚家族基因类蛋白。Lm-AGL15和葡萄AGL15的距离最近，而Lm-AGL15和龙眼AGL15的距离最远^{[16, 17, 18, 19]}。

PCR结果显示湘蕾型灰毡毛忍冬植株中的不同部位，均能检测到符合预期大小的Lm-AGL15基因片段，同时常规型灰毡毛忍冬花蕾中也检测到Lm-AGL15基因片段，湘蕾型灰毡毛忍冬植株中花蕾亮度最高，茎、叶亮度基本一致。说明Lm-AGL15基因主要在花育器官部位表达，同时湘蕾型灰毡毛忍冬植株花蕾中Lm-AGL15基因的表达远高于常规型灰毡毛忍冬花蕾中的表达（图 10）。

图 10

Fig. 10

图 10 灰毡毛忍冬不同品种及部位中Lm-AGL15基因的表达 Fig. 10 Expression of Lm-AGL15 genes in different parts and varieties of L. macranthoides

灰毡毛忍冬作为山银花主要药材来源，其生物活性物质高、产量高的特点被人们广泛熟知与接受，但如何解决灰毡毛忍冬蕾期短、采摘不及时是灰毡毛忍冬生产和应用中一个棘手的问题。因此克隆并研究湘蕾灰毡毛忍冬控制蕾期长短的相关基因，对于灰毡毛忍冬药用价值的开发及利用具有积极的促进作用。本研究通过对灰毡毛忍冬MADS-box基因家族中的Lm-AGL15 基因的研究，为从基因水平探索灰毡毛忍冬的生理生化研究奠定基础。

MADS-box基因参与植物花发育不同环节的调控，该基因家族可能形成复杂的复合物来调控花器官的特征以及控制花发育的过程。研究通过同源基因克隆，利用多聚酶链式反应（PCR）结合3’-RACE、5’-RACE技术，克隆了灰毡毛忍冬MADS-box基因AGL15的cDNA全长序列，命名为Lm-AGL15基因，将其提交到GenBank数据库，获得基因登录号为KR028478。该基因的核苷酸序列全长为1 399 bp，该基因序列的第1～222位核苷酸为基因的5’UTR，第1 018～1 399位核苷酸为基因的3’UTR，含有16 bp的PolyA结构，其中包括一个795 bp的完整开放阅读框（ORF）编码264个氨基酸。同时研究表明，Lm-AGL15基因编码蛋白的二级结构以α-螺旋为主，Lm-AGL15在结构上有很高的同源性，与MADS-box家族基因相比都含有MADS与K-box两个保守的功能区域，且分成4个区，N端是60个氨基酸的MADS结构域，蛋白的中部为69个氨基 酸K-box，MADS区和K区之间为27个氨基酸的I区，C端区域包含57个氨基酸，该基因还含有MADS-box基因D类基因特有的AG motif I和AG motif II，表明Lm-AGL15是灰毡毛忍冬的AGAM（AG）类基因。经BLASTp分析发现其与多条AGL15基因具有较高相似性，且含有一个相同的CArG（C-[A/T]rich-G）基序的DNA结合元件，此结构推测能够激活或抑制特异基因的表达^{[20, 21, 22, 23]}。

同时研究发现胚珠发育时，AG基因得以表达，在拟南芥Arabadopsas thaliana (L.) Heynh.的研究中，AG同源基因均有类似的表达特征，拟南芥AGL15基因有控制拟南芥蕾期长短的作用，当该基因过表达时，拟南芥花蕾期延长且不易开花。这些基因在将要产生雄蕊和心皮原基的分生组织、雄蕊和心皮原基、雄蕊和心皮以及胚珠中表达。在对葡萄AGL15基因的研究中发现其在胚珠中特异表达，表明葡萄AGL15有类似AGAMOUS基因的功能。定量PCR分析表明，Lm-AGL15基因在湘蕾型花蕾中高度表达且远高于常规型花蕾中的表达量，与AGL15基因在拟南芥花中的表达类似，与相同属葡萄AGL15基因的表达一致，推测Lm-AGL15基因在灰毡毛忍冬蕾期延长发育的过程中具有重要的调控作用。这也丰富了D类基因在其他植物中的分布^[24]。

因此获得Lm-AGL15基因的cDNA全长序列，并利用生物信息学对Lm-AGL15基因的功能域和结构进行分析和预测，发现Lm-AGL15具有MADS-box家族基因典型特征，为对于探明一些蕾期延长型突变的分子机制和利用基因调控技术进行蕾期延长育种具有重要意义。同时为开展该基因的表达研究，进一步确定其功能奠定了基础^[25]。