四逆汤出自张仲景《伤寒论》：“少阴病，脉沉者，急温之，宜四逆汤。”全方由附子、干姜、甘草3味药组成，有温中驱寒、回阳救逆之功，主治阳虚欲脱、冷汗自出、四肢厥逆、下利清谷、脉微欲绝。现代研究表明，四逆汤对改善心肌缺血-再灌注造成的损伤、治疗心力衰竭、对抗急性缺血性心肌梗死、增强心肌收缩力以及治疗冠心病、心绞痛方面具有良好的疗效^{[1, 2, 3, 4]}。心肌缺血是心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢异常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态^[5]。本研究基于四逆汤对缺血心肌的保护作用，以四逆汤及不同组方配伍为研究对象，对比分析其对大鼠心肌缺血的影响，以揭示四逆汤组方配伍的科学内涵，初步探索其作用机制。

MK3酶标仪（Thermo Fisher）；MK2洗板机（Thermo Fisher）；TG16离心机（长沙英泰仪器有限公司）；DNP-9052型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。

复方丹参滴丸（天津天士力制药股份有限公司，批号140513，每丸27 mg），四逆汤（批号141222SNT）、附子甘草合煎液（批号141222FZGC）、附子干姜合煎液（批号141222FZGJ）、甘草干姜合煎液（批号141222GCGJ）、附子单煎液（批号141222FZ）、干姜单煎液（批号141222GJ）、甘草单煎液（批号141222GC）均为实验室自制，药液质量浓度均为0.5 g/mL。7个样品中指标性成分定量测定结果见表 1，均符合《中国药典》2015年版规定。

表 1 (Table 1)

表 1 7个样品中指标性成分质量分数 Table 1 Contents of index components of seven samples 样品 质量分数/(mg∙g−1) 6-姜辣素 甘草酸 单酯型生物碱 四逆汤 4.38 8.52 4.31 附子干姜合煎液 2.63 — 0.96 附子甘草合煎液 — 11.30 3.41 附子单煎液 — — 0.54 甘草干姜合煎液 4.88 15.58 — 甘草单煎液 — 20.76 — 干姜单煎液 2.44 — —

表 1 7个样品中指标性成分质量分数 Table 1 Contents of index components of seven samples

氯化三苯基四氮唑染料（TTC），美国Sigma公司；垂体后叶素（Pit，批号140401），南京新百药业有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、天冬氨酸转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、乳酸试剂盒均由北京雅安达生物技术有限公司提供；水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂）。

雄性SD大鼠，体质量（250±20）g，雌性SD大鼠，体质量（230±20）g，由成都达硕生物科技有限公司提供，动物合格证号SCXK（川）2013-24。

适应性饲养后，SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性组、四逆汤组、附子甘草组、附子干姜组、甘草干姜组、附子组、甘草组、干姜组，每组12只，雌雄各半。四逆汤组^[6]按5.0 g/kg ig给药，其余各给药组按各药液中药材占四逆汤中药材比例折算给药，阳性组ig给予复方丹参滴丸药液（0.09 g/kg），对照组、模型组ig蒸馏水。各组给药均1次/d，连续5 d。期间自由摄食、饮水。

末次给药后1 h各给药组与模型组ip Pit 15 U/kg，对照组ip等量生理盐水。

造模1 h后用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）ip麻醉大鼠，取出心脏，生理盐水洗净，剪去心耳，滤纸吸干，将心脏切片，每片厚1～2 mm。置于1% TTC磷酸缓冲液（pH 7.4）中，于37 ℃恒温培养箱避光染色10 min。利用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）对染色后采集的心肌图像进行两色分割，计算心肌梗死范围。

造模1 h后对各组大鼠进行股动脉取血并取出心脏。血样进行离心处理，取上清液，即为血清样品；心脏组织在冰浴条件下用玻璃匀浆机制成组织匀浆液，即为心脏组织样品，其他具体操作按相关试剂盒说明书进行。

实验数据以x±s表示，采用SPSS 19.0软件处理，多组间均数两两比较采用单因素方差分析。

模型组大鼠心肌梗死范围显著高于对照组（P＜0.01）；四逆汤组、阳性组、附子甘草组、附子干姜组、附子组心肌梗死范围显著低于模型组（P＜0.01）；甘草组、干姜组、甘草干姜组心肌梗死范围与模型组无显著性差异。结果见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 各组大鼠心肌梗死范围的比较 (x±s,n = 12) Table 2 Comparison on extension of myocardial infarction of rats in each group (x±s,n = 12) 组别 剂量/(g∙kg−1) 心肌梗死范围/% 对照 — 0.00±0.00 模型 — 8.62±1.47## 复方丹参滴丸 0.09 3.93±1.03** 四逆汤 5.00 3.81±1.62**▲▲ 附子干姜 3.13 4.74±1.27**▲▲ 附子甘草 3.75 5.37±1.37**△ 附子 1.88 6.61±0.50**△△ 甘草 1.88 8.37±1.00 甘草干姜 3.13 8.21±1.05 干姜 1.25 8.53±1.15 与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01；与四逆汤组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01；与附子组比较：▲▲P＜0.01，表 4同 ##P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs model group; △P < 0.05 △△P < 0.01 vs Sini Decoction group; ▲▲P < 0.01 vs Fuzi group,Table 4 is same

表 2 各组大鼠心肌梗死范围的比较 (x±s,n = 12) Table 2 Comparison on extension of myocardial infarction of rats in each group (x±s,n = 12)

模型组大鼠心肌MDA、乳酸的量高于对照组（P＜0.01），SOD活性、GSH-Px量低于对照组（P＜0.05）；四逆汤组、阳性组、附子甘草组、附子干姜组、附子组大鼠心肌MDA、乳酸的量均显著低于模型组（P＜0.05、0.01）；四逆汤组、阳性组、附子干姜组能提高模型大鼠心肌SOD活性（P＜0.05）；四逆汤组、阳性组能显著提高模型大鼠心肌GSH-Px活性（P＜0.01）；甘草组、干姜组、甘草干姜组大鼠心肌SOD、MDA、GSH-Px水平与模型组比较无显著性差异。结果见表 3。

表 3 (Table 3)

表 3 各组大鼠心肌MDA、SOD、GSH-Px、乳酸水平比较 (x±s,n = 12) Table 3 Comparison on levels of MDA,SOD,GSH-Px,and lactic acid in myocardium of rats in each group (x±s,n = 12) 组别 剂量/(g∙kg−1) MDA/(nmol∙mL−1) SOD/(U∙mL−1) GSH-Px/(nmol∙mL−1) 乳酸/(ng∙L−1) 对照 — 114.57±40.18 285.86±30.93 1 256.74±450.37 345.75± 61.54 模型 — 193.38±28.96## 199.46±40.47# 817.96±235.55# 530.20±107.42## 复方丹参滴丸 0.09 122.97±25.17** 274.50±68.72 1 224.17±355.10 353.73± 98.62** 四逆汤 5.00 128.36±37.13** 282.57±49.20 1 283.72±271.82** 338.00± 87.33** 附子干姜 3.13 145.93±36.46 273.27±75.88 1 229.39±169.98 373.20±109.51 附子甘草 3.75 144.26±34.99 254.40±48.63 1 152.99±355.10 389.51± 50.51 附子 1.88 144.97±39.35 247.96±92.86 1 127.53±368.64 394.90± 63.97 甘草干姜 1.88 153.34±39.84 207.68±37.99 882.21±183.55 480.33±103.82 甘草 3.13 152.90±19.94 230.03±36.80 848.51±167.47 521.27±207.17 干姜 1.25 167.38±61.85 207.01±78.68 947.56±170.92 479.04±115.55 与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：P＜0.05 **P＜0.01，表 4同 #P< 0.05 ##P < 0.01 vs control group; P < 0.05 **P < 0.01 vs model group,Table 4 is same

表 3 各组大鼠心肌MDA、SOD、GSH-Px、乳酸水平比较 (x±s,n = 12) Table 3 Comparison on levels of MDA,SOD,GSH-Px,and lactic acid in myocardium of rats in each group (x±s,n = 12)

模型组大鼠血清LDH、CK、AST水平显著高于对照组（P＜0.01）；四逆汤组、阳性组、附子甘草组、附子干姜组、附子组能降低心肌缺血大鼠血清LDH、CK、AST水平（P＜0.05、0.01）；甘草组、干姜组、甘草干姜组血清LDH、CK、AST水平与模型组比较无显著性差异。结果见表 4。

表 4 (Table 4)

表 4 各组大鼠血清LDH、CK、AST水平比较 (x±s,n = 12) Table 4 Comparison on levels of LDH,CK,and AST in serum of rats in each group (x±s,n = 12) 组别 剂量/(g∙kg−1) LDH/(U∙mL−1) CK/(U∙L−1) AST/(IU∙L−1) 对照 — 276.12± 41.42 518.04± 97.71 124.48±25.81 模型 — 385.16± 28.69## 784.88± 68.77## 183.12±20.84## 复方丹参滴丸 0.09 285.35± 45.92** 481.80±108.34** 115.42±16.45** 四逆汤 5.00 272.20± 44.78** 463.02± 97.49** 111.45±36.92** 附子干姜 3.13 281.09± 45.92** 594.96±136.55 118.76±37.75** 附子甘草 3.75 301.46± 44.09** 596.64±136.21 126.00±21.94** 附子 1.88 328.67± 29.86*△ 605.68±105.46 123.26±27.71** 甘草干姜 1.88 378.17± 35.31 652.65±126.44 162.58±22.11 甘草 3.13 368.10±108.60 734.45±194.57 168.30±28.18 干姜 1.25 380.07± 31.36 718.19±132.17 164.20±37.74

表 4 各组大鼠血清LDH、CK、AST水平比较 (x±s,n = 12) Table 4 Comparison on levels of LDH,CK,and AST in serum of rats in each group (x±s,n = 12)

对表 2～4中含附子的4个组方进行组间比较，结果附子组及附子甘草组的大鼠心肌梗死范围显著高于四逆汤组（P＜0.05、0.01），附子干姜组大鼠心肌梗死范围低于附子组（P＜0.01）；四逆汤组的LDH水平低于附子组（P＜0.05）；而在CK、AST、SOD、MDA、GSH-Px、乳酸水平上各组间无明显差异。

四逆汤组、附子干姜组、附子甘草组、附子组能显著减少心肌梗死范围，说明以上4组药物对缺血心肌具有保护作用，而其他3组（甘草组、干姜组、甘草干姜组）无抗心肌缺血作用。综合考虑心肌梗死面积及7种生化指标的影响，对大鼠缺血心肌的保护程度依次为四逆汤组＞附子干姜组＞附子甘草组＞附子组，而甘草干姜组、甘草组、干姜组对其影响不明显。四逆汤组通过减少心肌MDA、乳酸的量，降低血清LDH、CK、AST水平，提高心肌SOD、GSH-Px活性，改善心肌缺血大鼠的心脏损伤。这与实验室前期研究四逆汤中3味药合煎，能够促进有效成分姜辣素、单酯型生物碱类成分溶出的实验结果相吻合，体现了四逆汤中“相须/相使”与“相杀/相畏”的七情配伍。将含附子的4个组方组大鼠的7种生化指标水平进行组间对比分析，发现仅在心肌LDH水平上附子组与四逆汤组存在差异，在其他生化指标上无明显差异，说明四逆汤的回阳救逆之功并非通过单一的抗氧化途径来实现，而是多成分、多靶点、多环节的共同调控作用。

Pit可引起冠状动脉痉挛，血管外周阻力增大，心肌负荷加重，从而出现心肌供血不足和心肌损伤。本研究采用ip Pit 造成大鼠的急性心肌缺血模型，方法简单有效，可操作性强^[8]。现代药理研究表明，四逆汤通过清除氧自由基、提高SOD活性、改善能量代谢、抑制细胞凋亡、增强线粒体锰超氧化物歧化酶（MnSOD）mRNA转录、抗失血性休克大鼠肠黏膜损伤等作用，对心肌缺血-再灌注损伤起到保护作用^{[9, 10, 11, 12]}。本实验中所测定的7个生化指标中MDA水平和SOD活性为评定氧自由基生成及膜结构破坏的重要指标；GSH-Px能清除过氧化物代谢产物，保护心肌细胞膜结构和功能完整；LDH、CK、AST可作为判断心肌缺血损伤程 度的指标；乳酸为无氧呼吸的产物^[13]。附子组大鼠血清中LDH、CK、AST水平的降低表明附子对心肌缺血大鼠的心肌具有保护作用，且附子可减少心肌MDA、乳酸释放，配伍干姜后可提高心肌SOD活性；再配伍甘草后可提高心肌GSH-Px活性。附子配伍干姜后能够增强其清除自由基的作用从而增强其回阳救逆之功，全方3味药合用能增强其清除过氧化物代谢产物的能力，使其对缺血心肌作用达到最强，为阐释四逆汤遣方用药的科学性提供实验基础。