石菖蒲AcoriTatarinowiiRhizoma为天南星科菖蒲属植物石菖蒲Acorustatarinowii Schott.的干燥根茎^[1]。石菖蒲中挥发油性成分是其主要活性成分，有较好的益智、脑保护效果，且具有平喘、增强肠管蠕动、抑制吗啡戒断症状等作用^[2]。

据报道无溶剂微波提取法利用微波辐射能“内加热”的特点可加快挥发油提取速度，是一种快速、高效的挥发油提取方法^{[3, 4]}。挥发油提取时将药材和羰基铁粉混合物装入瓶中，无任何溶剂，羰基铁粉吸收微波辐射加热，随温度升高，细胞内压逐渐增高，膨胀破裂，挥发性组分自动扩散，随着水蒸气一同被蒸馏出来^{[5, 6, 7]}。水蒸气蒸馏法是提取挥发油的传统方法，在生产实验中应用广泛，但存在加热时间长，消耗能量大的不足。本实验主要对石菖蒲的无溶剂微波提取工艺进行优化，并与水蒸气蒸馏法提取成分对比分析。

Agilent7890A气相色谱仪，安捷伦公司；MDS-5微波消解仪，上海新仪微波化学科技有限公司；Shimadzu QP 2010气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；色谱柱（Rtx-5 ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm）；α-细辛醚（flukar analytital，质量分数≥97.0%，批号101274717），Sigma公司；正己烷，国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸钠，北京化工厂；羰基铁粉（200 nm粒径），北京兴荣源科技有限公司。

石菖蒲药材于2015年2月购于安国市昌达中药材饮片有限公司，经中国中医科学院中药资源中心陈敏研究员鉴定为天南星科菖蒲属植物石菖蒲Acorustatarinowii Schott.干燥根茎的饮片，粉碎过3号药典筛。

气相色谱条件：程序升温，初始温度60 ℃，以3 ℃/min的升温速率升至140 ℃，保持1 min，然后以2 ℃/min的升温速率升至190 ℃，保持1 min，最后以40 ℃/min的升温速率升至230 ℃，保持3 min；汽化室温度260 ℃；检测器温度为250 ℃，进样口温度为230 ℃，载气为高纯氦气，体积流量1.0 mL/min。质谱条件：电离方式EI，电子能量70eV，扫描范围m/z 35～500。

取α-细辛醚对照品适量，精密称定，加正己烷制成含α-细辛醚6.021 mg/mL的溶液，即得，4 ℃储存，备用。

取收集到的挥发油，正己烷萃取^[8]，定容于10 mL量瓶中，超声溶解，加过量无水硫酸钠吸水，即得，4 ℃储存，备用。

精密吸取对照品溶液0.2、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL，进行测定，以峰面积为纵坐标（Y），α-细辛醚进样量为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程为Y＝968.82X－58.854，r＝0.9991，α-细辛醚在1.20～60.21 mg线性关系良好。

精密吸取对照品溶液1 μL，重复进样测定6次，测得峰面积的RSD为0.48%，表明精密度良好。

取6份石菖蒲药材10.0 g在微波功率600 W、微波加热时间5 min和羰基铁粉加入量为4 g的条件下提取，制备供试品溶液，测定，结果α-细辛醚质量分数的RSD为0.88%，表明本法重复性良好。

取同一份供试品溶液，分别于制备后1、2、4、8、12、24 h进样1 μL，测得α-细辛醚峰面积的RSD为0.97%。

取已测定的供试品溶液6份，每份约含有α-细辛醚15 mg，加入约20 mg的α-细辛醚，进样1 μL，计算其回收率和RSD值，结果平均回收率为98.30%，RSD为1.07%。

α-细辛醚是石菖蒲的主要有效成分之一，且性质稳定不易氧化，列为工艺筛选所需考察的主要指标之一，权重系数定为0.3。

据报道，α-细辛醚、β-细辛醚、γ-细辛醚为石菖蒲药材中质量分数最高的3个有效成分，以三者峰面积之和占总峰面积的百分比定为另一考察指标，权重系数设为0.3。

挥发油的总体积是评价出油率的重要指标，也列入评价指标，权重系数设为0.4。

以A、B、C一同作为评价指标，3个评价指标的权重设定计算公式：OD＝0.3 A/ A_max＋0.3B/B_max＋0.4 C/C_max

称取石菖蒲药材10.0 g，以微波加热功率（a）、单位质量药材羰基铁粉加入量（b）、微波加热时间（c）为因素，确立L₉(3⁴) 正交试验，设计见表 1。收集挥发性成分，4 ℃储存，备用。按“2.1.3”项下制备供试品溶液，测定，计算α-细辛醚提取量，直观分析见表 1，方差分析见表 2。

表 1(Table 1)

表 1 L9(34)正交试验设计与结果 Table 1 Design and results ofL9(34)orthogonal test 试验号 a/W b/(g∙g−1) c/min d (误差) A/mg B/% C/mL OD 1 600 (1) 0.2 (1) 3 (1) (1) 3.71 68.33 0.028 46.19 2 600 (1) 0.3 (2) 4 (2) (2) 7.78 69.50 0.057 54.37 3 600 (1) 0.4 (3) 5 (3) (3) 31.99 69.77 0.235 99.93 4 800 (2) 0.2 (1) 4 (2) (3) 7.75 69.63 0.057 54.39 5 800 (2) 0.3 (2) 5 (3) (1) 20.66 69.89 0.152 78.75 6 800 (2) 0.4 (3) 3 (1) (2) 12.38 69.7 0.091 63.11 7 1 000 (3) 0.2 (1) 5 (3) (2) 18.17 69.66 0.132 73.82 8 1 000 (3) 0.3 (2) 3 (1) (3) 4.59 68.95 0.034 48.07 9 1 000 (3) 0.4 (3) 4 (2) (1) 12.44 69.77 0.138 69.28 K1 200.49 174.40 157.37 194.22 K2 196.25 181.19 178.04 191.30 K3 191.17 232.32 252.50 202.39 R 9.32 57.92 95.13 11.09

表 1 L9(34)正交试验设计与结果 Table 1 Design and results ofL9(34)orthogonal test

表 2(Table 2)

表 2 方差分析 Table 2 Analysis of variance 误差来源 偏差平方和 自由度 F比 显著性 a 14.516 2 0.659 b 668.345 2 30.339 P＜0.05 c 1 669.029 2 75.765 P＜0.05 d (误差) 22.029 2 F0.05(2,2) = 19.00 F0.01(2,2) = 99.00

表 2 方差分析 Table 2 Analysis of variance

方差分析结果表明，3因素对其影响顺序为微波加热时间＞羰基铁粉加入量＞微波加热功率。按α＝0.05，微波加热时间对α-细辛醚提取量具有显著影响，微波加热功率和羰基铁粉加入量无显著影响，收集得到挥发油0.235 mL，为正交试验中挥发油得率最优者，结合挥发油得率与α-细辛醚提取量，优选最佳实验工艺为A₁B₃C₃，即微波功率600 W，2 g羰基铁粉，微波加热5 min。

无溶剂微波提取样品的色谱图（色谱条件同“2.1.1”项）见图 1，由气相色谱图可知α-细辛醚、β-细辛醚、γ-细辛醚等峰面积较大的色谱峰均达到基线分离，适用峰面积归一化法进行分析。

图 1 石菖蒲无溶剂微波提取法的GC 图Fig.1 GC of solvent-free microwave extraction of Acori Tatarinowii Rhizoma

为考察该工艺的合理性、稳定性，按照正交试验优选的最佳工艺条件验证3批，结果见表 3。3批验证试验中1组结果小于正交试验最优工艺，其余2组结果均大于最优工艺，正交试验和3批验证4者的RSD为0.94%，说明该工艺稳定、可行。

表 3(Table 3)

表 3 3批验证结果 Table 3 Verification of three batches of samples 试验号 A/mg B/% C/mL OD 1 29.80 75.01 0.223 98.10 2 30.81 73.36 0.233 100.04 3 30.68 73.83 0.232 99.95 RSD/% 1.81 1.15 2.40 1.10

表 3 3批验证结果 Table 3 Verification of three batches of samples

按《中国药典》2010年版挥发油测定法（附录XD）项下的乙法提取挥发性成分，取石菖蒲药材10.0 g，加12倍量的水，至挥发油不再增加为止，收集挥发油0.175 mL，制样，4 ℃储存，备用。

按“2.13”项制备方法制备水蒸气蒸馏法的供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件测定α-细辛醚提取量，共得α-细辛醚提取量为29.09 mg。

按“2.1.1”项下的色谱条件，测定无溶剂微波法与水蒸气蒸馏法样品，质谱图见图 2，经计算机谱库检索（NIST 08，NIST 08s）和人工解析，确定化合物的结构，见表 4，分析鉴定出41种挥发性物质，其中无溶剂微波提取法分析鉴定36种物质，占挥发油总量的95.71%，共测得α-细辛醚31.99 mg，水蒸气蒸馏法分析鉴定39种物质，占挥发油总量的93.67%，共测得α-细辛醚29.09 mg；采用面积归一化法，石菖蒲挥发油中主要挥发性测定成分α-细辛醚、β-细辛醚和γ-细辛醚百分比在无溶剂微波提取法为4.12%、55.11%和10.54%，而水蒸气蒸馏法则分别为5.39%、47.03%和9.15%。

图 2 石菖蒲无溶剂微波提取法 (A) 和水蒸气蒸馏提取法 (B) 的GC-MS 图Fig.2 GC-MS of solvent-free microwave extraction (A) and steam distillation (B) of Acori Tatarinowii Rhizoma

表 4(Table 4)

表 4 GC-MS 分析水蒸气蒸馏法与无溶剂微波法提取石菖蒲挥发性成分的结果 Table 4 GC-MS analyzed volatile oil constituents in Acori Tatarinowii Rhizoma of between solvent-free microwave extraction and steam distillation 序号 tR/min 化合物 分子式 相对分子质量 质量分数/% 无溶剂微波法 水蒸气蒸馏提取法 1 3.33 2-糠醛 C5H4O2 96 0.07 未检出 2 5.51 α-派烯 C10H16 136 未检出 0.07 3 5.95 莰烯 C10H16 136 未检出 0.33 4 6.73 β-派烯 C10H16 136 未检出 0.08 5 8.36 柠檬烯 C10H16 136 未检出 0.08 6 8.45 桉油醇 C10H18O 154 未检出 0.16 7 11.00 芳樟醇 C10H18O 154 0.25 0.32 8 12.87 樟脑 C10H16 136 0.31 0.47 9 14.01 龙脑 C10H18O 154 0.13 0.11 10 14.35 4-松油醇 C10H18O 154 0.04 0.09 11 15.00 α-松油醇 C10H18O 154 0.04 0.09 12 22.63 +(−)-长叶环烯 C15H24 204 0.05 0.12 13 23.08 α-柏木烯 C15H24 204 0.01 0.04 14 23.33 β-榄香烯 C15H24 204 0.10 0.09 15 23.84 丁香酚甲醚 C11H14O2 178 0.73 0.31 16 24.54 香橙烯 C15H24 204 0.20 0.27 17 24.86 β-石竹烯 C15H24 204 0.04 0.11 18 25.01 白菖烯 C15H24 204 0.15 0.30 19 26.19 甲基丁香酚 C11H14O2 178 2.69 2.94 20 26.87 香柠檬油烯 C15H24 204 0.05 0.05 21 27.53 脱氢异菖蒲二醇 C15H24O 220 2.09 1.94 22 27.94 顺式甲基丁香酚 C11H14O2 178 0.55 0.46 23 28.17 α-古云烯 C15H24 204 0.15 0.20 24 28.59 β-荜澄茄烯 C15H24 204 0.43 0.28 25 28.86 菖蒲酮 C15H24O 220 4.86 3.47 26 29.20 喇叭烯氧化物 C15H24O 220 1.20 2.04 27 29.85 α-二去氧菖蒲烯 C15H20 200 0.43 0.42 28 30.59 γ-榄香烯 C15H24 204 0.04 0.05 29 31.40 γ-细辛醚 C12H16O3 208 10.55 9.15 30 31.58 (−)-斯巴醇 C15H24O 220 0.64 0.34 31 31.73 石竹烯氧化物 C15H24O 220 0.12 0.33 32 32.93 乙酸龙脑酯 C12H20O2 196 5.84 1.17 33 35.08 β-细辛醚 C12H16O3 208 55.11 47.03 34 35.48 荜澄茄醇 C12H16O3 208 0.72 0.47 35 36.28 α-荜澄茄醇 C12H16O 222 0.39 0.19 36 36.62 α-细辛醚 C12H16O3 208 4.13 5.39 37 39.68 紫丁香醛 C10H16O2 168 2.90 5.65 38 40.24 喇叭茶醇 C15H26O 222 4.06 6.91 39 41.13 δ-愈创烯 C15H24 204 0.11 0.22 40 41.88 α-甜没药萜醇醇 C15H26O 222 0.07 0.22 41 55.48 十九烷 C19H40 268 0.06 未检出

表 4 GC-MS 分析水蒸气蒸馏法与无溶剂微波法提取石菖蒲挥发性成分的结果 Table 4 GC-MS analyzed volatile oil constituents in Acori Tatarinowii Rhizoma of between solvent-free microwave extraction and steam distillation

无溶剂微波提取法中所用材料羰基铁粉已经广泛应用于食品、农学的研究中^{[9, 10, 11]}，羰基铁粉在300 ℃、1 bar（100 kPa）的条件下分解为Fe和CO。本实验在常压条件下进行，羰基铁粉性质稳定，即便可能有痕量的羰基铁粉混入到挥发油中，也可便捷地采用溶解萃取等方式去除。

预试验对无溶剂微波提取法中各因素进行了单因素考察，发现如在微波功率1000 W、微波加热时间5 min和单位药材羰基铁粉量为0.4 g的条件下挥发油外观、气味均良好，若超过此条件会导致药材焦糊，使挥发油的颜色加深，产生焦糊味道，而条件低于微波功率600 W、微波加热时间3 min和单位药材羰基铁粉量为0.2 g的条件下，难以提出挥发油。所以本实验设计表中3因素3水平均依据预试验结果而确定。

综合评分法分别以3种细辛醚百分比之和、α-细辛醚提取量、挥发油体积作为评价指标，根据各指标的重要程度给予各自权重评分，然后采用加权相加，得到综合评分数据OD值，该值兼顾了挥发油的总量，也充分考虑了石菖蒲挥发油中有效成分α-细辛醚、β-细辛醚、γ-细辛醚的贡献。

无溶剂微波提取法作为一种快速、高效的提取方法，具有绿色、节能的优点。羰基铁粉能很好的吸收微波，使微波的利用率提高，在时间上缩短微波加热时间，使石菖蒲挥发油能更快的被提取出来。与传统方法相比，此方法无需溶剂，节约能源，挥发油纯度高，有较好的应用价值和广阔前景。