2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.24.013 |
银黄滴丸（Yinhuang Drop Pills，YDP）是由金银花提取物和黄芩提取物组成的复方制剂，具有清热、解毒、消炎的功效，可用于急慢性扁桃体炎、急慢性咽喉炎、上呼吸道感染等症的治疗[1-2]。银黄滴丸是由银黄片[3]改剂型而来，其质量标准主要利用薄层色谱（TLC）法对黄芩苷和绿原酸进行鉴别，HPLC法对两者进行定量测定。而黄芩和金银花含有皂苷类和黄酮类等多种化学成分，仅测定黄芩苷和绿原酸2种成分不能客观全面地反映银黄滴丸的内在质量[4-7]。
中药指纹图谱是中药质量控制的一种有效方法，是一种多指标的质量控制模式，包含信息量大，它可以比较全面地反映所含化学成分的种类和数量，表征中药复杂成分与其内在质量的关系，从而能够全面、综合地反映和控制中药的质量，在中药制剂的质量评价和中药生产的质量控制中有着广泛的应用[8-17]。为此，本实验采用HPLC法建立银黄滴丸的指纹图谱，并采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》（2012）进行相似度评价，为实现其全面质量控制奠定基础[18-19]。
1 仪器与材料Agilent 1200高效液相色谱仪，包括G1311A泵、G1329A进样器、G1314B检测器、G1316A柱温箱，美国安捷伦；BS124S电子分析天平，德国赛多利斯股份公司；KQ-500DB超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂为分析纯。对照品新绿原酸（质量分数≥98.0%，批号PRF7051143）、隐绿原酸（质量分数≥98.0%，批号15020203）、3, 4-O-二咖啡酰奎宁酸（3, 4-O-DA，质量分数≥98.0%，批号1542210），成都普瑞科技开发有限公司；对照品绿原酸（质量分数以96.2%计，批号110753-201415）、3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸（3, 5-O-DA，质量分数以92.0%计，批号111782-201405）、4, 5-O-二咖啡酰奎宁酸（4, 5-O-DA，质量分数以94.1%计，批号111894-201102）、黄芩苷（质量分数以93.3%计，批号110715-201318），中国食品药品检定研究院。银黄滴丸样品10批（批号B150602、B150606、B150608、B150910、B151002、B151221、B160304、B160306、B160325、B160505，分别编号S1~S10）由浙江维康药业股份有限公司提供。
金银花样品（批号为20160401）于2016年4月14日购于安徽纪淞堂中药饮片有限公司，经浙江维康药业股份有限公司李建良副主任中药师鉴定为忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花；黄芩样品（批号为160323）于2016年04月20日购于安徽纪淞堂中药饮片有限公司，经浙江维康药业股份有限公司李建良副主任中药师鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为Kromasil 100-5C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液，梯度洗脱：0~15 min，5%~20%乙腈；15~30 min，20%~30%乙腈；30~40 min，30%乙腈；检测波长327 nm；理论塔板数按绿原酸峰计不低于2 000。
2.2 供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.6 g，精密称定，置100 mL棕色量瓶中，加50%甲醇约80 mL，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 对照品溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成含绿原酸40 μg/mL的对照品溶液，即得。
2.4 银黄滴丸指纹图谱的建立及相似度研究 2.4.1 参照峰的选择绿原酸为银黄滴丸中主要药理活性成分之一，且参照《中国药典》2015年版银黄片的指纹图谱测定方法[20]，确定绿原酸峰为HPLC指纹图谱的参照峰，色谱图见图 1-A。
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图 1 绿原酸对照品HPLC谱图(A)、10批银黄滴丸指纹图谱(B)和银黄滴丸对照指纹图谱(C) Fig.1 HPLC of chlorogenic acid reference substance (A), HPLC fingerprint of 10 batches of YDP (B), and HPLC specific chromatogram of YDP (C) |
2.4.2 重复性试验
取同一批样品（B150602），按“2.2”项下方法同时制备6份供试品溶液，分别进样测定。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD在0.05%~0.10%，相对峰面积RSD在0.47%~0.90%，符合指纹图谱的要求，表明重复性良好。
2.4.3 精密度试验取同一供试品（B150602）溶液，连续进样6次，参照《中国药典》2015年版银黄片的指纹图谱测定方法[20]，以绿原酸作为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD在0.05%~0.09%，相对峰面积RSD在0.14%~0.74%，符合指纹图谱的要求，表明精密度良好。
2.4.4 稳定性试验取同一份（B150602）供试品溶液，分别在0、4、8、12、15、24 h进样测定。结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积无明显变化，各共有峰的相对保留时间RSD在0.02%~0.13%，相对峰面积RSD在0.11%~0.57%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。
2.4.5 指纹图谱的建立10批样品指纹图谱的色谱峰均在40 min内全部出完。对所得指纹图谱进行分析，选择稳定性好，吸收强，特征明显的色谱峰为参照峰（2号峰，S），参照《中国药典》2015年版银黄片的指纹图谱测定方法[20]，确定供试品色谱的共有峰为7个，计算各共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，色谱图见图 1-B。各共有峰相对保留时间与相对峰面积见表 1、2。
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表 1 指纹图谱共有峰相对保留时间 Table 1 Fingerprint common peak relative retention time |
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表 2 指纹图谱共有峰相对峰面积 Table 2 Fingerprint common peak relative peak area |
2.4.6 相似度计算
相似度是评价中药指纹图谱的一个重要参数，运用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》（2012），对10批次银黄滴丸的HPLC指纹图谱进行分析，建立银黄滴丸HPLC指纹图谱的对照图谱，见图 1-C。各样品（批号B150602、B150606、B150608、B150910、B151002、B151221、B160304、B160306、B160325、B160505）指纹图谱与该对照图谱比较，得到相似度均为1.0。
2.5 指纹图谱中共有峰的药材归属与指认 2.5.1 对照品溶液的制备取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3, 4-O-DA、3, 5-O-DA、4, 5-O-DA、黄芩苷对照品适量，加50%乙醇分别制成含新绿原酸23.30 μg/mL、绿原酸49.18 μg/mL、隐绿原酸50.61 μg/mL、3, 4-O-DA 50.18 μg/mL、3, 5-O-DA 48.65 μg/mL、4, 5-O-DA 48.29 μg/mL、黄芩苷50.85 μg/mL的对照品溶液。
2.5.2 单味药材溶液的制备取金银花药材532.4 mg、黄芩药材292.5 mg，置100 mL棕色量瓶中，加50%甲醇约80 mL，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.5.3 共有峰的药材归属与指认取“2.5.1”及“2.5.2”项下制备的溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，通过保留时间分析，指纹图谱中标定的7个共有峰中1、2、3、4、5、6号峰来自金银花药材，7号峰来自黄芩药材。通过与7种对照品谱图比对，其中1号峰为新绿原酸，2号峰为绿原酸，3号峰为隐绿原酸，4号峰为3, 4-O-DA，5号峰为3, 5-O-DA，6号峰为4, 5-O-DA，7号峰为黄芩苷。色谱图见图 2。
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图 2 银黄滴丸HPLC指纹图谱中各共有峰归属 Fig.2 Each common peak attribution in fingerprint of YDP |
3 讨论
分别考察了50%甲醇、50%乙醇提取溶剂及20、30、40 min超声提取时间对结果的影响，结果表明以50%甲醇为提取溶剂，超声30 min即可[21]。
实验曾选择了3种不同厂家的色谱柱（Kromasil 100-5C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；Agilent extend-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；依利特Hypersil BDS C18，250 mm×4.6 mm，5 μm），考察了方法的耐用性。各组分在3种不同厂家的色谱柱中出峰顺序一致，理论板数、分离度均能较好地满足系统适用性要求，表明所采用的色谱条件耐用性良好，综合对称因子等各因素本实验选择Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱。
10批样品相似度结果均为1.0，本实验所建立的银黄滴丸指纹图谱检测方法灵敏、简便、快速，可有效地控制药品质量。
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