2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.23.021 |
2. 丽水学院医学与健康学院, 浙江 丽水 323000 ;
3. 台州学院生命科学学院, 浙江 椒江 318000
2. College of Medicine and Health, Lishui University, Lishui 323000, China ;
3. College of Life Science, Taizhou University, Jiaojiang 318000, China
斑叶兰属Goodyera L.植物为兰科（Orchidaceae）地生草本，具根状茎，因部分物种的叶片常带有杂色斑纹，故名斑叶兰；该属植物全世界约有40种，我国有29种[1]。斑叶兰属的部分种类如斑叶兰G. schlechtendaliana Rchb. f.、高斑叶兰G. procera (Ker-Gawl.) Hook.和大花斑叶兰G. biflora (Lindl.) Hook. f.等有较高的药用价值，具活血止痛、清肺止咳、消肿解毒和软坚散结的功效，可用于治疗肺结核、跌打损伤、尿路感染、支气管炎、毒蛇咬伤和痈疖疮疡等[2-4]。药材加工后容易改变形态结构，利用传统的中药鉴定手段难以准确鉴别，分子标记具有鉴定准确性高和重现性好等优点，目前已广泛应用于中药材鉴定[5]。
常见的分子标记技术有DNA条形码（DNA barcoding）、随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）等[6]，核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）是一种重要的DNA条形码，由2个间隔区（ITS1和ITS2）及它们之间的5.8 S组成，5.8 S在进化上十分保守，而ITS1和ITS2在序列长度和碱基组成上的变异较大，是研究遗传多样性、系统发育和物种鉴定的重要分子标记[7]。近年来，科研人员就斑叶兰属植物的药理作用、保护生物学、组织培养、化学成分和新记录种发现等方面开展了一些研究[8-12]。但有关斑叶属植物rDNA ITS序列克隆方面未见报道，本研究以7种斑叶兰属植物为材料，在克隆各自ITS序列的基础上，对它们进行序列分析，为该属植物的分子鉴定和系统发育分析奠定基础。
1 材料与仪器 1.1 材料斑叶兰Goodyera schlechtendaliana Rchb. f.、绒叶斑叶兰Goodyera velutina Maxim.、小斑叶兰Goodyera repens (L.) R. Br.、光萼斑叶兰Goodyera henryi Rolfe、高斑叶兰Goodyera procera (Ker -Gawl.) Hook.、大花斑叶兰Goodyera biflora var. macrantha (Lindl.) Hook. f.和绿花斑叶兰Goodyera viridiflora (Bl.) Bl. 7种植物，样品的采集地点及海拔信息见表 1，植物均由蒋明鉴定。每个物种采集5棵植株的叶片，分别装入取样袋后置于冰盒中带回实验室，先用大量的自来水冲洗，然后用无菌水冲洗2~3次，用吸水纸吸干后贮存于−80 ℃低温冰箱中备用。
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表 1 斑叶兰属植物的来源 Table 1 Sources of plants in Goodyera L. |
1.2 仪器
BIO-RAD C1000型PCR仪；北京六一DYY-12型电泳仪和电泳槽；Eppendorf移液枪；BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像系统；BECKMAN Allegra 64R高速冷冻离心机；超净工作台；恒温培养箱；恒温摇床。“新型植物基因组DNA快速提取试剂盒”购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
2 方法 2.1 基因组DNA的提取DNA提取根据试剂盒说明书进行，每个样品取0.1 g用于DNA的提取。基因组DNA经电泳检测后，置于−80 ℃低温冰箱中保存备用。
2.2 ITS序列的克隆、转化和测序克隆ITS序列所用的PCR引物分别为ITSUP：5’-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’和ITSDN：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应总体积为20 μL，在PCR管中依次加入15.8 μL无菌ddH2O，2 μL 10×PCR缓冲液（含20 mmol/L Mg2+）、0.35 μL上游引物（20 μmol/L）、0.35 μL下游引物（20 μmol/L）、0.20 μL 200 ng/μL的DNA、0.55 μL dNTPs（Genview）和0.55 μL 2 U/μL的Taq DNA聚合酶（北京鼎国公司）。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，55.8 ℃退火45 s，72 ℃延伸70 s，循环次数为33。
2.3 PCR产物的回收、连接和测序PCR产物经琼脂糖凝胶分离后，用刀片割取含目的片段的胶块。DNA片段的回收采用北京鼎国的“快速凝胶回收纯化试剂盒”，操作根据试剂盒说明书进行。各取2 μL纯化片段，连接到p-GEM T-easy载体（Promega），经转化大肠杆菌Trans5α化学感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）、蓝白斑筛选及菌液PCR验证后，各取3份阳性菌液用于测序。菌液PCR的体系和程序同“2.2”项，模板改为0.1 μL菌液。
2.4 序列分析测序结果经整理后保存为Fasta格式，用ClustalX 1.81软件进行序列比对[13]；G+C值利用Excel计算获得；遗传距离计算及系统发育树的构建采用MEGA 3.1软件[14]，建树方法为邻接法（neighbor joining，NJ），自举检测次数为1 000。
3 结果与分析 3.1 ITS序列的特征以基因DNA为材料，利用ITSUP和ITSDN引物对克隆到的7种斑叶兰属植物的rDNA进行ITS序列分析。测序结果显示，每个物种5棵单株的ITS序列完全一致。序列分析结果表明，7种斑叶兰属植物的ITS全长为700~702 bp，绒叶斑叶兰的ITS序列最长，光萼斑叶兰和大花斑叶兰次之，长度为701 bp，其余4种的ITS长度均为700 bp。ITS1的长度为239~240 bp，ITS2为298~300 bp，而5.8 S的长度十分保守，均为162 bp（表 2）。7种斑叶兰属植物ITS序列的G+C值为49.4%~53.0%，高斑叶兰的G+C值最高，绿花斑叶兰次之，为50.3%，绒叶斑叶兰的G+C值最低。
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表 2 斑叶兰属植物ITS序列的长度及G+C值 Table 2 Length of ITS sequences and G+C value in plants of Goodyera L. |
3.2 ITS序列的比较分析
利用ClustalX 1.81对齐ITS序列，发现它们共有可变位点107个、信息位点34个，序列中存在大量的缺失/插入和转换/颠换现象，这些信息位点可完全区分这7种斑叶兰属植物（图 1）。ITS1和ITS2的信息位点数分别为22和11，5.8 S序列中存在1个信息位点，位于+341处。ITS1序列的+130、+139、+196和+213位发生缺失/插入现象，ITS2仅+147位存在缺失/插入，而在5.8 S序列中未检测到。转换/颠换现象在ITS1和ITS2中十分普遍，次数分别为56和47，而5.8 S序列中的转换/颠换现象较少，仅发生3次，分别位于+326、+341和+363。斑叶兰和小斑叶兰的ITS序列差异最小，仅存在4个碱基的差异，分别位于+37、+113、+598和+687处；绒叶斑叶兰和光萼斑叶兰的ITS存在8个碱基的差异，它们是+32、+112、+140、+213、+511、+608、+609和+651位（图 1）。
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黑色方框表示5.8 S序列 Black boxes indicate 5.8S sequences 图 1 斑叶兰属药用植物的ITS序列 Fig.1 ITS sequences of seven medicinal plants in Goodyera L. |
3.3 系统发育分析
利用Mega软件计算遗传距离，结果表明，7种斑叶兰属植物的遗传距离为0.006~0.110。其中，斑叶兰和小斑叶兰的遗传距离最近；绒叶斑叶兰和光萼斑叶兰次之，遗传距离为0.010；高斑叶兰和小斑叶兰、高斑叶兰和大花斑叶兰之间的遗传距离最远，分别为0.106和0.110。7种斑叶兰属植物在系统发育树上分为4组，大花斑叶兰、光萼斑叶兰和绒叶斑叶兰聚为一组（Ⅰ），斑叶兰和小斑叶兰聚为一组（Ⅱ），而绿花斑叶兰及高斑叶兰单独处于2个不同分支（Ⅲ和Ⅳ）（图 2）。
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图 2 基于ITS序列构建的7种斑叶兰属植物的系统发育树 Fig.2 Phylogenetic tree of seven kinds of plants in Goodyera L. constructed based on ITS sequences |
4 讨论
正确鉴定中药是安全用药和药用植物合理开发的保证，因地理分布和所处生境不同，植物的形态和化学成分差异较大，利用传统的形态学、显微法、理化性质和化学指纹图谱鉴定具有一定的局限性[15]。随着分子生物学技术的发展，分子标记已广泛应用于药用植物的资源鉴定、亲缘关系确定和多样性研究[16]。rDNA-ITS是一种重要的DNA条形码，它具有信息位点丰富、序列长度保守和核苷酸变异快等特点，已广泛用于物种鉴定、植物分类和系统发育研究[6]。Jeanmougin等[13]以野豌豆属Vicia L. 8种药用植物为材料，克隆到各自的ITS序列，共有信息位点33个，特异性鉴别位点29个，可将这些植物完全区分；邵婧等[14]以茅苍术Atractylodes lancea (Thunb.) DC.及其近缘种为材料获得各自的ITS2序列，共鉴定到7个变异位点，可用茅苍术药材的鉴定。本研究中，7种斑叶兰属植物ITS序列的信息位点十分丰富，达34个，利用它们可将7种植物完全区分。
在被子植物中，rDNA-ITS的全长由ITS1、5.8 S和ITS2组成，长度500~700 bp，ITS1的长度为187~298 bp，ITS2为187~252 bp，其中的5.8 S最为保守，序列长度通常为163~164 bp[17-18]。不同种属植物的ITS序列差异较大，山姜属Alpinia L.植物ITS1的长度为201~231 bp，ITS2的长度为253~281 bp，而5.8 S的长度变异最小，为163~164 bp[19]；远志属Polygala L. 7药用植物ITS1的长度为279~291 bp，ITS2的长度为211~219 bp[20]；鼠尾草属Salvia L. 27种药用植物的ITS1长度为226~233 bp，ITS2的长度为216~228 bp[21]。本研究中，7种斑叶兰属植物的ITS全长为700~702 bp，其中的ITS1长度为239~240 bp，ITS2长298~300 bp，而5.8 S的长度与石豆兰属Bulbophyllum L.、银杏Ginkgo biloba L.和川牛膝Cyathula officinalis Kuan一致，均为162 bp[22-24]。
本研究以7种斑叶兰属植物为材料，分别克隆到它们的ITS全长序列，测序结果表明7种斑叶兰属植物ITS序列的信息位点丰富，利用这些位点可将它们完全区分，研究结果为斑叶兰属植物的分子鉴定和遗传多样性研究奠定了基础。
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