2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.23.011 |
2. 天津药物研究院, 天津 300193
, YUAN Yong-bing2, CHEN Wen-jing1, WU Ling-fang1, LI Shi1, QI Qi1, CUI Ya-ping1, ZHANG Lan-zhen1
2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China
Waters e2698 HPLC色谱仪，配有2998二极管阵列检测器，Empower 3工作站，美国Waters公司；Agilent 1100 HPLC色谱仪，配有G1315B二极管阵列检测器，Agilent Chemstation工作站，美国Agilent公司；OHAUS AX124ZH型万分之一电子天平，常州奥豪斯仪器有限公司；KQ-500DE超声波清洗仪，昆山超声仪器有限公司；Sartorious BT25S型十万分之一电子分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司。
色谱柱：DIKMA Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，DM）；Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，AJL）；TechMate C18-ST柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，TCM）。
DTI、CT、TI、TIIA对照品，质量分数均大于98%，批号分别为15020102、15010613、15050711、14122512，均购自成都曼斯特生物科技有限公司。
乙腈，Fisher，色谱纯；娃哈哈纯净水；其余均为分析纯。丹参片（D）、复方丹参片（F）、冠心丹参胶囊（G）均购自各地药店，为11个不同厂家市售药品，见表 1。冠心丹参胶囊倾出内容物，之后将3种制剂分别研细，备用。
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表 1 样品来源信息 Table 1 Information of samples from different sources |
2 方法与结果 2.1 定量测定方法建立及方法学考察 2.1.1 色谱条件
色谱柱为DIKMA Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液（60：40）；检测波长270 nm；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL。在上述色谱条件下，4种成分的色谱峰分离度良好，见图 1。
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图 1 混合对照品(A)、丹参片(D1, B)、复方丹参片(F1, C)、冠心丹参胶囊(G1, D)、复方丹参片阴性样品(E)和冠心丹参胶囊阴性样品(F)的HPLC图 Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A), Danshen Tablet (D1, B), Compound Danshen Tablet (F1, C), Guanxin Danshen Capsule (G1, D), negative sample of Compound Danshen Tablet (E) and negative sample of Guanxin Danshen Capsule (F) |
2.1.2 对照品溶液的制备
分别取DTI、CT、TI和TIIA对照品适量，精密称定，加甲醇配制成质量浓度分别为100.8、102.0、94.4、98.8 μg/mL的对照品储备液。
分别精密吸取DTI对照品储备液（质量浓度100.8 μg/mL）0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mL，CT、TI和TIIA对照品储备液（质量浓度分别为102.0、94.4、98.8 μg/mL）0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL置10 mL量瓶中，甲醇定容制成6个不同质量浓度的混合对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备取丹参不同制剂粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理（功率200 W，工作频率40 kHz）20 min，放至室温后，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，13 000 r/min离心10 min，取上清液，即得。
2.1.4 阴性样品溶液的制备根据《中国药典》2015年版复方丹参片和冠心丹参胶囊的处方和制法，制备缺丹参阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备阴性样品溶液。
2.1.5 线性关系考察分别精密吸取“2.1.2”项下系列混合对照品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得各成分的回归方程、相关系数（r）和线性范围分别为DTIY=4 945 020 X-6 730，r=0.999 5，线性范围10.1~241.9 ng；CTY=6 174 029 X-21 190，r=0.999 5，线性范围20.4~326.4 ng；TIY=5 215 695 X-15 301，r=0.999 5，线性范围18.9~302.1 ng；TIIAY=6 737 605 X-16 997，r=0.999 7，线性范围19.8~316.2 ng。
2.1.6 精密度试验取G2号样品，按“2.1.3”项下方法制备的供试品溶液，连续进样6次，记录DTI、CT、TI、TIIA的峰面积，计算各成分峰面积的RSD分别为0.96%、0.98%、1.11%、1.01%，显示仪器精密度良好。
2.1.7 重复性试验取G2号样品，按“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，分别进样，记录DTI、CT、TI、TIIA的峰面积，测得样品中各成分量的平均值分别为0.099、0.533、0.245、0.753 mg/g，RSD分别为1.22%、1.35%、0.81%、0.80%，表明该方法重复性良好。
2.1.8 稳定性试验取G2号样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别于样品制备后0、2、4、8、12、24 h进样，记录DTI、CT、TI、TIIA的峰面积，计算各成分峰面积的RSD分别为1.05%、0.77%、0.95%、1.30%，表明供试品溶液在24 h内较为稳定。
2.1.9 加样回收率试验取已测定的G2号样品约0.1 g，共6份，精密称定，加入一定量对照品溶液，使样品中待测成分量与对照品加入量之比约为1：1，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样并记录DTI、CT、TI、TIIA的峰面积，计算各成分的平均加样回收率分别为101.63%、99.05%、101.22%、97.26%，RSD分别为1.02%、1.06%、1.13%、1.05%，表明该方法准确度良好。
2.2 QAMS质量评价模式的建立 2.2.1 fi/s的计算目前，对fi/s的计算多采用多点校正法和斜率校正法，2种算法在计算过程中略存差异。多点校正法通过公式fi/s=(Ai/Ci)/(As/Cs)计算各成分的fi/s，式中Ai为待测成分i的峰面积，As为内参物s的峰面积，Ci为待测成分的浓度或质量，Cs为内参物的浓度或质量。样品中待测成分量的计算公式为Ci′=Cs′Ai′/(fi/sAs′)，式中Ai′为样品中待测成分i的峰面积，As′为样品中内参物s的峰面积，Ci′为样品中待测成分i的浓度或质量，Cs′为样品中内参物s的浓度或质量[16]。
在待测成分标准曲线A=aC+b中，当a/b大于100时，b/a可忽略，此时可采用斜率校正法计算fi/s，公式为fi/s=ai/as，式中ai为待测成分i斜率，as为内参物s斜率。样品中待测成分量的计算公式为Ci′=Ai′/(fi/sas)，式中Ai′为样品中待测成分i的峰面积，Ci′为样品中待测成分i的质量[8, 17]。
本实验以TIIA为内参物，比较了在Waters色谱仪+DM色谱柱条件下2种不同算法对fi/s的影响，结果发现2种算法计算结果无显著性差异，见表 2。考虑到斜率校正无需逐个浓度计算平均fi/s，且在样品指标成分量计算过程中更为简便，因此，在后续实验中采用斜率校正法建立的fi/s进行计算。
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表 2 不同计算方法得到的fi/s Table 2 fi/s obtained by different calculation methods |
2.2.2 fi/s耐用性考察
（1）不同仪器和色谱柱对fi/s的影响：实验在不同实验室中进行，考察了Waters和Agilent 2种不同的色谱系统分别在DM、AJL、TCM 3种不同色谱填料下对待测成分fi/s的影响，结果见表 3、4。结果显示不同仪器和不同色谱柱对待测成分fi/s均无显著影响（RSD均小于0.85%）。
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表 3 不同仪器对fi/s的影响 Table 3 Influence of different instruments on fi/s |
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表 4 不同色谱柱对fi/s的影响 Table 4 Influence of different columns on fi/s |
（2）不同体积流量对fi/s的影响：采用Waters色谱系统和DM色谱柱，分别测定在0.9、1.0、1.1 mL/min体积流量条件下待测成分的fi/s，结果fi/s重现性良好，RSD在0.51%~2.88%，见表 5。
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表 5 不同体积流量对fi/s的影响 Table 5 Influence of different flow rates on fi/s |
（3）不同柱温对fi/s的影响：采用Waters色谱系统和DM色谱柱，分别测定在28、30、32 ℃柱温条件下待测成分的fi/s，结果表明在柱温微小变化时，fi/s波动较小，RSD小于3.50%，见表 6。
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表 6 不同柱温对fi/s的影响 Table 6 Influence of different column temperature on fi/s |
2.2.3 待测成分色谱峰定位
待测成分色谱峰的准确定位是QAMS质量评价模式建立过程中的关键点[16-17]。目前，对待测成分色谱峰的准确定位多采用保留时间差法、相对保留值法和线性回归定位法。
其中，保留时间差法和相对保留值法分别通过待测成分i和内参物s间保留时间的差值和比值进行计算。线性回归定位法通过色谱热力学理论分析推导得出，在相同分析条件下，即使采用不同的色谱系统和色谱柱，成分的保留时间仍存在一定的线性关系[16-18]。
本实验以TIIA为内参，分别考察了保留时间差法和相对保留值法在不同仪器和色谱柱下的重现性，并以Waters色谱系统和DM色谱柱条件下计算得到的保留时间差和相对保留值为标准值，通过相对误差（RD）对3种方法定位结果进行评价，比较各成分保留时间的计算值与真实值之间的差异。结果表明，在不同仪器和不同色谱填料下保留时间差的RSD较大，重现性、耐用性较差；相对保留值法计算得到的保留时间与实测保留时间相比，相对误差较线性回归定位法大，但该方法已能满足实验需求，且在实际应用中更加简便快捷。
鉴于此，建议采用相对保留值法对待测成分进行准确定位，DTI、CT、TI与TIIA之间的相对保留值分别是0.314、0.518、0.561。见表 7、8。
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表 7 线性回归定位法计算结果 Table 7 Calculation results of linear regression location method |
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表 8 3种方法定位结果的RD Table 8 Relative error of positioning results by different methods |
2.3 样品测定及验证
为了验证所建立QAMS方法的准确性，本实验采用“2.1”项下建立的方法通过ESM计算得到3种丹参制剂中DTI、CT、TI、TIIA的量，之后通过QAMS法得到的fi/s，根据TIIA实测量，计算其余待测成分的量，最后对ESM和QAMS所得结果进行比较。结果见表 9，结果表明2种方法所得结果无显著性差异，待测成分的fi/s可靠，所建立的丹参酮类成分QAMS质量评价模式在丹参制剂中的应用准确性好、可行性强。
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表 9 待测成分QAMS和ESM定量测定结果 Table 9 Determination of four tanshinones by QAMS and ESM methods |
3 讨论
供试液的制备釆用单因素变量法，分别考察了不同提取方法、提取溶剂和提取时间对3种丹参制剂中丹参酮类成分提取率的影响，优选出100倍量甲醇超声提取20 min可将丹参酮类成分提取完全，得到图谱的色谱行为良好。本研究以TIIA为内参物，建立了丹参酮类成分QAMS定量测定方法，课题组将对更多丹参制剂进行QAMS法的验证。
丹参片、复方丹参片和冠心丹参胶囊均收载于《中国药典》2015年版[10]，丹参为君药或臣药，制备工艺均采用高体积分数乙醇和水分别对脂溶性丹参酮类和水溶性丹酚酸类成分进行提取，但2类成分极性相差较大，当内参物与待测成分色谱保留性质差异较大时，会引起成分fi/s较大偏差[3]。因此，建议分别对丹参制剂中2类成分建立QAMS定量测定方法。
实验结果显示同一剂型即使是同一品牌不同批次的产品，其有效成分量差异比较大，客观反映出药品质量参差不齐，这与原料药的产地、加工、炮制、提取工艺等都有关系，所以加强中药材质量和生产工艺的监管十分必要。
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