泽泻Alismatis Rhizoma为泽泻科泽泻属植物泽泻Alisma orientale (Sam.) Juzep.的干燥块茎，具有利水渗湿、泄热、化浊降脂等功效，临床用于治疗小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋痛、高脂血症等^[1-2]。泌尿系结石是一种世界范围的常见病，其中大多数为草酸钙结石^[3]。泽泻临床上是治疗泌尿系结石的常用传统中药，现代药理研究表明泽泻提取物对体内、外草酸钙结石的生长与聚集有明显的抑制作用^[2]。樊龙昌等^[4]通过考察泽泻水煎剂对肾及输尿管草酸钙结石患者的结石形成和排出的影响，发现泽泻水煎剂能有效地减少草酸钙晶体的生长，从而抑制肾、输尿管结石的形成。区淑蕴等^[5-6]通过体外药理实验进一步确认醋酸乙酯部位为泽泻防治泌尿系统结石的有效部位，再通过研究泽泻三萜提取物对大鼠尿草酸钙结石形成的影响，发现总三萜是泽泻防治泌尿系统结石的有效成分。周雪峰等^[7]应用生物活性导向分离法，从泽泻抗草酸钙结石的醋酸乙酯活性部位分离得到24-乙酰泽泻醇F和24-乙酰泽泻醇A等化合物。

Jin等^[8]从泽泻中分离得到了一些三萜类化合物，经核磁共振鉴定为23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇B、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇Q等。Liu等^[9]采用UPLC/Q-TOF-MS法从泽泻中分离得到20个三萜类成分，经鉴定为泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇F等。到目前为止，从泽泻中分离的三萜成分已达60多种^[10-11]，而哪些三萜成分是泽泻抗草酸钙结晶的活性成分鲜有报道，并且中药是多种活性成分组合群共同发挥作用^[12-13]，但是关于泽泻活性组分配伍体外抗草酸钙结晶的研究也未见报道。因此，本实验围绕泽泻中6种主要三萜成分^[14-15]，包括泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇F和24-乙酰泽泻醇F，通过研究其体外抗草酸钙结晶活性，明确泽泻抗草酸钙结石的药效物质，并进一步采用均匀设计法筛选最佳抑石效果的泽泻三萜配伍组分配比，为泽泻抗结石活性成分及其组分配伍新药研发提供实验依据，也为中药组分^[16-17]研究提供一种思路和手段。

SHY-2A型水浴恒温振荡器，江苏金伟实验仪器厂；0.22 μm微孔滤膜，天津市津腾实验设备有限公司；AA240FS型火焰原子吸收分光光度计，美国安捷伦科技有限公司；AR223CN型电子分析天平，上海奥豪斯仪器有限公司；PHS-3C型pH精密酸度仪，上海雷磁仪器厂。

三羟甲基氨基甲烷（批号77-86-1）、氯化钙（批号10043-52-4），北京索莱宝科技有限公司；柠檬酸，天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号XK 13-011-00013；草酸钠，国药集团化学试剂有限公司，批号20151218；草酸钙，上海源叶生物科技有限公司，批号563-73-4；氯化锶，西陇化工股份有限公司，批号10025-70-4；对照品泽泻醇A（批号MUST-16032402，质量分数≥98.0%）、24-乙酰泽泻醇A（批号MUST-15022104，质量分数≥98.0%）和泽泻醇F（批号MUST-15052014，质量分数≥98.0%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；对照品23-乙酰泽泻醇B（中国食品药品检定研究院，批号111846-201102，质量分数≥98.5%）；对照品泽泻醇B和24-乙酰泽泻醇F为本实验室自制，经HPLC检测质量分数均大于98.0%；甲醇，德国默克公司。

分别称取10 mg的泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇F和24-乙酰泽泻醇F单体粉末，精密称定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解，制成质量浓度1.0 mg/mL的溶液，以备用。

取pH 6.5 Tris缓冲液48 mL，加入0.03 mol/L氯化钙和0.03 mol/L草酸钠各1.0 mL，混匀得0.6 mmol/L的草酸钙亚稳饱和液^[5]50 mL。取50 mL草酸钙亚稳饱和液，加入待测溶液1 mL，在37 ℃恒温水浴箱振荡10 min，取样3 mL用针头过滤器经直径0.22 μm微孔滤膜滤过于离心管内，然后加入0.5 mL质量浓度5 mg/mL的一水草酸钙籽品^[5]悬液（CaC₂O₂·H₂O）搅拌30 s，继续置恒温水浴箱振荡孵育1.5 h，再取3 mL溶液同样经0.22 μm微孔滤膜，并收集在离心管内。分别取各续滤液0.5 mL于另外的离心管内，然后均加入0.25%氯化锶4.5 mL（稀释10倍），再用原子吸收分光光度计测定加籽晶前后各离心管内滤液中Ca²⁺的浓度（C）^[5]。根据公式计算草酸钙结晶生长抑制指数。

采用SPSS 18.0软件对实验数据进行分析；计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，其中P＜0.05表示有统计学意义。均匀设计结果应用DPS软件，进行多种回归分析，然后选择最合适的一个分析方法。

取适量配制好的泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇F和24-乙酰泽泻醇F单体溶液分别稀释成10、100、200 μg/mL，按“2.2”项下方法测定各个单体不同质量浓度体外抗草酸钙结晶的作用，然后从中筛选出最适合的质量浓度范围进行组分配伍。

对不同质量浓度6种泽泻单体体外抗草酸钙结晶作用进行测定，结果见表 1。发现大部分单体在10 μg/mL和100 μg/mL时的效果是较好的，而200 μg/mL时可能由于三萜类因质量浓度过高而有小部分析出导致药效不佳，因此，最终筛选10~100 μg/mL的质量浓度作为均匀设计实验的剂量范围。

表 1(Table 1)

表 1 不同质量浓度的泽泻单体成分体外抗草酸钙结晶作用(x±s, n=3) Table 1 Effects of Alismatis Rhizoma with different concentration on resisting calcium oxalate calculus in vitro (x±s, n=3) 质量浓度/ (μg·mL-1) 抑制指数/% 空白(甲醇) 泽泻醇A 24-乙酰泽泻醇A 泽泻醇B 23-乙酰泽泻醇B 泽泻醇F 24-乙酰泽泻醇F  10 67.33±5.14 112.00±9.12** 102.33±7.42** 87.67±6.93* 115.00±10.92** 77.67±8.65 106.33±11.28** 100 115.67±11.27** 133.00±10.08** 75.33±6.11 94.33±8.06* 83.33±6.54* 110.33±9.25** 200 161.67±15.26** 84.67±7.53* 104.33±12.74** 88.33±9.37* 88.00±9.01* 119.67±10.33** 与空白组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs blank group, same as below

表 1 不同质量浓度的泽泻单体成分体外抗草酸钙结晶作用(x±s, n=3) Table 1 Effects of Alismatis Rhizoma with different concentration on resisting calcium oxalate calculus in vitro (x±s, n=3)

将24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇F和泽泻醇F 6种抗草酸钙结晶活性成分作为考察因素，每个因素在筛选的活性范围内各设12个水平。通过DPS设计均匀设计表（表 2），共得12种组方（N1~N12）。每个组方形成的待测溶液按“2.2”项中的方法，测定其对体外草酸钙结晶生长的抑制指数。

表 2(Table 2)

表 2 U12(126)均匀设计试验分配及结果(x±s, n=3) Table 2 Disposition and result of U12(126) uniform design experiment (x±s, n=3) 组别 质量浓度/(μg·mL-1) 抑制指数/% 泽泻醇A 24-乙酰泽泻醇A 泽泻醇B 23-乙酰泽泻醇B 泽泻醇F 24-乙酰泽泻醇F 空白 - - - - - - 62.33±6.24 N1 18.18 75.45 83.63 18.18 42.73 34.55 128.67±21.83** N2 75.45 50.91 10.00 10.00 75.45 59.09 139.00±3.00** N3 83.64 10.00 67.27 26.36 50.91 91.82 149.33±17.47** N4 67.27 26.36 100.00 83.64 26.36 50.91 138.33±27.64** N5 100.00 83.64 42.73 50.91 18.18 67.27 126.67±17.78** N6 26.36 18.18 34.55 59.09 100.00 42.73 133.67±21.78** N7 10.00 42.73 59.09 100.00 67.27 75.45 156.67±16.50** N8 91.82 59.09 75.45 75.45 83.64 18.18 124.00±7.00** N9 50.91 91.82 91.82 42.73 91.82 83.64 139.33±11.72** N10 34.55 67.27 18.18 67.27 34.55 100.00 145.33±15.01** N11 59.09 100.00 26.36 91.82 59.09 26.36 186.00±25.06** N12 42.73 34.55 50.91 34.55 10.00 10.00 153.67±26.00** 阳性对照（枸橼酸） - - - - - - 130.33±10.15**

表 2 U12(126)均匀设计试验分配及结果(x±s, n=3) Table 2 Disposition and result of U12(126) uniform design experiment (x±s, n=3)

通过DPS软件设计均匀设计表，该均匀设计表的中心化偏差CD=0.198 2，开展6因素12水平的均匀设计试验，结果见表 2，其中阳性药为枸橼酸溶液（0.2 g/mL）。

通过DPS软件，将均匀设计的结果进行多种回归分析，考察各个参考因素的值，综合各个因素选择一个最合适的分析方法。每种分析方法的结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 每种方法分析的结果 Table 3 Analysis results of each method 参考因素 逐步回归 多因子及互作项逐步回归 线性回归 多因子及平方项逐步回归 P值 0.845 0 0.082 6 0.845 0 0.031 5 r值 0.000 0 0.993 8 0.687 6 0.999 1 d值 2.056 3 2.049 6 2.056 3 2.005 4

表 3 每种方法分析的结果 Table 3 Analysis results of each method

从结果可以看出，采用多因子及平方项逐步回归分析的效果是最佳的，所以最终选择其作为均匀设计实验结果的分析方法。

均匀设计实验的数据经多因子及平方项逐步回归分析，得拟合回归方程为Y=102.463 3+2.036 2 X₁-0.446 7 X₂+1.503 4 X₃-1.380 5 X₄-0.107 6 X₅+0.096 3 X₆-0.018 7 X₁²+0.005 0 X₂²-0.014 8 X₃²+0.014 6 X₄²（X₁为泽泻醇A质量浓度，X₂为24-乙酰泽泻醇A质量浓度，X₃为泽泻醇B质量浓度，X₄为23-乙酰泽泻醇B质量浓度，X₅为泽泻醇F质量浓度，X₆为24-乙酰泽泻醇F质量浓度），方程调整后相关系数r=0.999 1，P=0.031 5＜0.05，回归方程具有统计学意义，Durbin-Watson统计量d=2.005 4，接近2.0，提示方程拟合较好，其方差分析结果见表 4。均匀设计所得活性组分最佳配伍优化理论值为X₁=59.0 μg/mL，X₂=100.0 μg/mL，X₃=26.4 μg/mL，X₄=91.8 μg/mL，X₅=59.0 μg/mL，X₆=26.4 μg/mL，即最佳组分配比为泽泻醇A-24-乙酰泽泻醇A-泽泻醇B-23-乙酰泽泻醇B-泽泻醇F-24-乙酰泽泻醇F（2.2:3.8:1:3.5:2.2:1），理论抑制指数为188.29%。

表 4(Table 4)

表 4 方差分析 Table 4 Analysis of variance 变异来源 平方和 自由度 F值 P值 回归 3 154.399 4 10 609.808 7 0.031 5 残差 0.517 3  1 总变异 3 154.916 7 11

表 4 方差分析 Table 4 Analysis of variance

将均匀设计实验的结果进行数据分析，对DPS软件给出的最优组合进行验证，对比最优组合的预测值与实测值之间的接近程度。

将软件拟合的方程进行计算，对比计算的值与通过实验得到的值之间接近的程度（图 1），结果两值基本一致。并且对软件筛选的最佳理论配伍优化值进行验证实验，按照“2.5.3”项中优化理论值的各质量浓度进行3次验证，其抑制指数分别为179.21%、185.37%和193.04%，结果该方程可信度较高，且实测值与预测值接近。

图 1 计算值与实验值的折线图 Fig.1 Line chart of calculated and experimental values

首先，在设置12个水平的均匀设计之前，本实验对6种三萜成分各个单体（单因素）进行活性评价研究，每个单体设置了10、100、200 μg/mL 3个质量浓度水平，经过测试发现各个单体在10 μg/mL和/或100 μg/mL时均表现有良好的效果，而设置200 μg/mL时虽然各个化合物依然表现良好的效果，但是由于三萜类的疏水性，其在抗草酸钙结晶体系中有少部分的析出导致质量浓度准确性和可靠性下降；并且另一方面100 μg/mL的药效与200 μg/mL相比，除了泽泻醇A和B有增加外，其他4个化合物没有显著性差别，甚至发生活性下降现象（可能与析出干扰有关），因此，根据6个单体评价的结果，设置12个水平的均匀设计质量浓度范围为10~100 μg/mL。

从表 1和表 2结果可知，泽泻三萜单体组抗草酸钙活性抑制指数为88%~133%，而经过组分配伍后各配伍组的活性抑制指数为124%~180%，多数配伍组的活性显著优于单一三萜化合物，并且与阳性药相比，单一组分的泽泻三萜抗草酸钙结晶的活性基本都低于阳性药组，而进行6种单体组分配伍后，发现一些配伍组（如N7、N11、N12）的活性及最终优化的最佳比例组活性均高于阳性药组。

均匀设计^[18-19]只考虑试验点在试验范围内均匀散布，它可保证试验点具有均匀分布的统计特性，可使每个因素的每个水平做1次且仅做1次试验，着重在试验范围内考虑试验点均匀散布以求通过最少的试验来获得最多的信息，因而其试验次数比正交设计明显的减少，使均匀设计特别适合于多因素多水平的试验，因此适合于组分配伍最佳比例的优化研究。但是其统计分析则复杂于正交设计，本实验通过系统的比较逐步回归、多因子及互作项逐步回归、线性回归、多因子及平方项逐步回归4种均匀设计统计方法，优选后多因子及平方项逐步回归最能满足泽泻三萜抗草酸钙结晶模型的拟合，经过模型计算，拟合值和实验值基本吻合，方差分析结果P＜0.05，有统计学意义。最佳模型拟合的组分配伍组经过活性验证，验证值与预测值非常接近，从而优化筛选出泽泻体外抗草酸钙结晶的最佳组分配比。

中药组分配伍^{[16-17, 20]}是中药配伍的一种崭新的模式，它是经过各种优化设计方案筛选出对临床适应症有效的中药处方或单味中药活性成分最优配比组分，可以提高临床疗效。从中医药理论体系来说，单一的有效成分研究不是最终目的，在物质成分不断被揭示的基础上如何遵循复方配伍理论，回归到“中药组分配伍”，将是未来中药现代研究的方法和内容。

中药泽泻自古具有排石利尿功效，可与多种中草药配伍组成治疗尿路结石的传统方剂，如猪苓汤、五苓散等。现代药理研究表明泽泻肾草酸钙结石主要有效部位为泽泻醋酸乙酯部位^[5]，但是其药效物质没有完全明确，本实验考察了泽泻6个三萜类成分，其均具有体外抑制草酸钙结晶的作用，提示泽泻三萜类化合物是其抗结石的主要药效物质，并且本实验进一步采用均匀设计对其6种主要三萜类成分泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇F和24-乙酰泽泻醇F进行组分配伍，研究它们体外抑制草酸钙的作用，筛选出6种三萜类成分的最佳组分配伍为2.2:3.8:1:3.5:2.2:1，该比例下能最有效地抑制体外草酸钙结晶的形成。