中药旨在多成分协调起效，因此中药口服制剂的释药行为也将是直接影响中药整体发挥疗效的重要因素之一。杨岩涛等^[1]指出中医药现代化的特征是根据整体释放、同步溶蚀等原则来阐明中药多成分与人体的宏观与微观的物质作用规律。在此笔者认为现代中药已经发展到组分中药的层面，口服制剂也必然将发展成多元释放的系统，单组分中各成分其药理效应固然会表现出高度相似性，在单元释药的过程中制剂释药行为的设计也固然保持其一致性。成都中医药大学研究人员曾研究制备丹参-三七多组分同步均衡释药系统，指出多组分的释药也应该保持其释药的同步性^[2]。而笔者认为在多组分多元释药系统过程中，则应该针对治病特点、组分性质，有目的设计多组分多元释药行为，达到多组分协调起效的最终目的。

现代化中药口服制剂的释药过程将成为制剂领域今后需进一步研究的重点之一。本实验以银杏内酯单组分为模型药物，根据其组分性质，首先制备成银杏内酯单组分释药单元，进一步借助相似度分析、线性斜率分析对组分中各成分的释药量相似性和释药加速度相似性进行评价。试图为今后中药口服制剂释药行为评价提供参考。

银杏内酯（ginkgolides）是银杏科银杏属植物银杏Ginkgo bilobaL.根皮及叶的强苦味成分，是治疗心脑血管疾病的主要有效组分之一^[3-6]。银杏内酯被认为是最有临床应用前景的天然血小板活化因子受体拮抗剂，其拮抗活性与化学结构密切相关。实验证明银杏内酯结构中R₃为羟基或羟基数目增多时，对血小板活化因子（PAF）的拮抗活性减弱；而当R₂为羟基且R₃为H时，则活性显著增强^[7]。经过本课题组前期对银杏内酯组分（ginkgolides components，GC）结构优化实验研究发现银杏内酯A（GA）与银杏内酯B（GB）配比时，其抗凝作用更好，而且GA与GB相配比时，随着GB质量比例的递增，其抗凝血作用越强，配比范围在（1:2~1:6）的GA-GB组分为最优GC^[8]。但由于GC溶解性差，导致其口服利用度低下^[9]，这阻碍了其在临床中的应用。本实验以GC作为模型药物进行研究，借助自微乳释药系统（SMDDS）^[10-14]来改善提高GC的溶出，进而改善其生物利用度。

本实验鉴于GC的生物药剂学性质特点和SMDDS的优势，制备GC释药单元，用于改善GC的溶解性和生物利用度，并进一步分析GC自乳化释药单元释药行为的释药量及释药加速度相似性，为进一步设计与制备银杏双组分（银杏黄酮和内酯组分）多元释药系统做基础与参考。

1 仪器与材料

Agilent 1100高效液相色谱仪，美国Agilent科技公司；Malvern Zetasizer Nano ZS纳米粒度、Zeta电位和绝对分子量分析仪，英国马尔文仪器有限公司；电子天平，德国Mettler-Toledo公司；TGL-16B高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；CHA-S数显气浴恒温振荡器，金坛市双捷实验仪器厂；KQ5200型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；涡旋混合器，德国IKA VORTEX公司。

GC，GA、GB总量为94.89%，其组成为30.47% GA、64.42% GB，其中GA-GB≈1:2.15，由江苏康缘药业股份有限公司提供，批号110817；GA和GB对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为100862-200608、110863-200508），质量分数分别为99.9%和95.6%。

乙醇、甲醇、丙三醇，南京化学试剂有限公司；辛酸癸酸甘油三酯（GTCC），临沂市兰山区绿森化工有限公司；大豆油，阿拉丁试剂有限公司；聚山梨酯80（Tween 80，T80），国药集团化学制剂有限公司；聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH-40），江苏省海安石油化工厂；1, 2-丙醇、聚乙二醇（PEG）400，上海凌峰化学试剂有限公司；PEG 200，中国医药（集团）上海化学试剂公司；PEG 300，国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果 2.1 GA和GB定量分析 2.1.1 色谱条件^[15-17]

AgilentSB-C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（35:65）；柱温35 ℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长225 nm；蒸发光散射检测器；蒸发口温度105 ℃；雾化口温度70 ℃；漂移管温度30 ℃；载气体积流量2.8 L/min，色谱图见图 1。

2.1.2 对照品溶液的制备

分别精密称取GA、GB对照品5.06、6.34 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解稀释配制成质量浓度分别为506、634 μg/mL的对照品原液，待用。

2.1.3 供试品溶液的制备

精密称取适量GC置25 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得GC供试品溶液。

2.1.4 线性关系考察

取GA、GB的对照品原液，用甲醇分别稀释2、5、10、20、50倍，配制成一系列不同质量浓度的混合对照品溶液。GA质量浓度分别为253、101.2、50.6、25.35、10.12 mg/L；GB质量浓度分别为317、126.8、63.4、31.7、12.68 mg/L。按色谱条件，各质量浓度对照品溶液分别进样10 μL，用Agilent 1100高效液相色谱仪测定峰面积，以峰面积对数lnA对进样量对数lnm作线性回归，得回归方程：GA lnA=0.996 lnm+6.980，R²=0.999 8，线性范围10.12~253 mg/L；GB lnA=0.994 lnm+6.851，R²=0.998 8，线性范围12.68~317 mg/L。

2.1.5 精密度试验

分别精密吸取高、中、低3个不同质量浓度对照品溶液，分别含GA 50.60、25.35、12.65 mg/L和GB 63.4、31.7、15.85 mg/L，按“2.1.1”项下方法测定，每种质量浓度重复进样5次，连续测定5 d，计算结果的日内RSD分别为0.96%、1.5%、0.78%；日间RSD分别为2.8%、1.8%、0.75%，结果均小于3%，表明该方法精密度良好。

2.1.6 重复性试验

取GC原料药样品6份，按供试品溶液制备方法制备并分析，结果GA和GB色谱峰面积的RSD分别为2.25%和2.92%。

2.1.7 稳定性试验

精密称取同一GC原料药样品6份，分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定，计算GA和GB峰面积的RSD分别为2.14%和2.72%。

2.1.8 回收率试验

精密称取同一GC原料药样品9份，分为3组，每组分别加入一定量的对照品溶液（各含GA为1.40、1.75、3.50 mg，GB为1.37、1.71、2.68 mg），按色谱条件测定，进样20 μL进行分析，计算各对照品的平均加样回收率，GA平均加样回收率为102.0%，RSD为0.48%；GB平均加样回收率为99.73%，RSD为0.35%。

2.2 处方的筛选 2.2.1 油相、乳化剂、助乳化剂的确定

分别吸取不同的油、乳化剂、助乳化剂2 mL置于具塞试管中，加入过量的GC，超声1 h后，放入恒温振荡器中，37 ℃恒温震荡48 h，使GC充分溶解至过饱和，3 000 r/min离心15 min，精密吸取上清液0.5 mL，用甲醇稀释至50 mL，过0.45 μm微孔滤膜，每个供试品平行进样2针，根据线性回归方程计算GC（GA和GB）的溶解度。结果见表 1。结果显示，GC在各个油相中的溶解度差异不大，在各个乳化剂中T80的溶解度最高，而在助乳化剂中PEG 200的溶解度最高。因此选择T80为乳化剂，PEG 200为助乳化剂，初步确定处方为RH-40+T80+PEG 200或大豆油+T80+PEG 200或GTCC+T80+PEG 200。

2.2.2 伪三元相图的研究

在实验过程中发现RH-40和大豆油作为油相时，其与T80、PEG 200难以形成微乳，因此实验最终确定油相为GTCC。以水、油以及一定比例的混合乳化剂作为3个顶点，采用水滴定法绘制伪三元相图^[14]，确定微乳形成区域的趋势。分别按乳化剂和助乳化剂质量比例（K_m）为1:1、2:1、3:1、4:1混合，各乳化剂和助乳化剂的混合物和油相质量，按1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1在常温下涡旋混匀，分别精密称取1 g，采用水滴定法向各混合物中逐滴加入双蒸水，记录临界点，利用Origin 85软件绘制伪三元相图，比较各相图微乳区面积，并在达到平衡后观察澄明度和流动性，判断形成的微乳的类型，在此基础上明确形成微乳的各组分的质量范围，由此得出最佳空白微乳剂的处方。结果见图 2，其中混合乳化剂、油相2边与曲线所形成的区域为微乳区，其余为乳剂区。通过三元相图可得出当K_m值为4:1，即乳化剂T80与助乳化剂PEG 200的质量比为4:1时微乳区域较大，故选K_m=4:1。同时油相-混合乳化剂比例不同时，观察澄明度和流动性，得出形成微乳的能力。结果当油相-混合乳化剂质量比为1:9、2:8、3:7时均可以得到澄明、流动性好的溶液。

2.2.3 GC自乳化处方与载药量的确定

以最优的K_m=4:1为基础，制备油相与混合乳化剂质量比1:9、2:8、3:7的3个总质量为100 mg的空白自微乳，每个配比加入一定量的GC，常温下超声溶解，然后分别精密吸取0.1 mL，用双蒸水稀释至10 mL，混匀后测定粒径和Zeta电位，并观察静置48 h后有无析出现象，结果见表 2。

如表 2所示，随着药物用量的增加，自乳化粒径也随之增加，自微乳粒径分布于10~100 nm，其Zeta电位的绝对值均小于30 eV，故胶体稳定性较好。由于自微乳是透明或半透明的，热稳定性良好的液体分散体系，故当油相-混合乳化剂为3:7时，稀释后的微乳为乳白色不透明溶液，因此排除3:7的比例项。

粒径越小，油水界面积越大，稳定性越好。所以当油相与混合乳化剂质量比为1:9，其稳定性强于2:8，因此选择油相与混合乳化剂质量比为1:9。在之后的实验中发现，当空白处方为K_m=4:1，油相与混合乳化剂质量比为1:9，可形成稳定透明的自微乳液体分散体系，因此确定自微乳最终处方为T80与PEG 200质量比为1:9时，最大载药量为150 mg/g，但此时用双蒸水滴定药物会迅速析出。经多次试验后发现当载药量为100 mg/g时，药物相对较稳定，放置48 h无析出，故得出最佳载药量为100 mg/g。所以最佳处方为T80与PEG 200质量比4:1，T80和PEG 200与GTCC质量比（9:1），载药量为100 mg/g。

2.3 质量评价 2.3.1 制剂外观

按处方量制备GC自微乳制剂，分别以50、100、200、500倍加水乳化后，观察其外观形态，结果均为澄清透明的微乳溶液，略带淡蓝色乳光，且离心后无药物析出及分层。

2.3.2 粒径与Zeta电位测定

按处方制备GC自微乳制剂，用双蒸水稀释100倍，混匀乳化后测定粒径及其Zeta电位，结果制剂粒径分布均匀，粒径的平均值均在40 nm以下。混匀乳化后测得电位为−5.12~−4.89 mV，较稳定，见表 3。

2.3.3 稳定性试验

取一定量的GC自微乳制剂密封，分别于25 ℃（常温）、40 ℃（恒温箱）、4 ℃（冰箱）、−20 ℃（冰箱）内放置2、4、8、16、24、48 h后观察外观形态，发现无药物析出，且澄清透明不分层。于这些时间点分别取样过HPLC测得制剂中GC（GA+GB）银杏内酯质量浓度，得出其RSD值小于3%，说明该制剂的化学稳定性良好。

2.4 GC-SMDDS的体外溶出分析 2.4.1 GC-SMDDS溶出实验

取GC-SMDDS硬胶囊6粒（0.05 g/粒，约含GC 5 mg/粒），另取6粒自制的GC原料药（约含GC 5 mg/粒，按《中国药典》2015年版二部附录X C溶出度测定法第一法进行测定，分别以900 mL 0.1 mol/L纯水为溶出介质，转速为50 r/min，水浴温度为（37.0±0.5）℃。分别于30、60、80、100、120、140、180 min取样5 mL，同时补充同温度同体积的溶出介质。将所取的样品经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液按HPLC条件测定，考察GC-SMDDS溶出度，比较GA和GB在GC原料药与GC-SMDDS中溶出度曲线，见图 3。

2.4.2 组分中成分释放量相似度分析

在药物制剂的开发与研究过程中，药学工作者通过采用f₂相似因子法^[18-19]比较药物在不同处方中的溶出曲线的相似程度，来推测及评价处方、工艺等因素改变后对药物本身体外释放行为的影响。该方法判定结果可靠且处理过程简单，已被美国FDA和欧盟EMEA作为评价体外溶出曲线相似度的方法收载。其计算方法如下：

R_t与T_t分别代表参比和受试制剂在时间点t的平均累积释放率，n为测试时间点个数；在本实验中R_t与T_t分别代表GA和GB在时间点t的累积释放率

通过对处方工艺完全相同的3批GC-SMDDS的溶出度试验，借助f₂相似因子法评价GA和GB溶出曲线的相似程度，分析见表 4，计算得到GA与GB在GC-SMDDS中的相似因子f₂为96.9，相似因子f₂越接近100，溶出曲线的相似程度越高，因此可以推测出GA和GB在GC-SMDDS中的溶出释放量极为相似，相似度为96.9%。

2.4.3 组分中成分释放加速度相似度的分析

通过考察GA和GB的溶出曲线并对2成分释放行为进行线性分析。GA溶出曲线的线性方程为y=0.004 6 x+0.218 1，斜率为0.004 6；GB溶出曲线的线性方程为y=0.004 0 x+0.258 5，斜率为0.004 0。通过斜率（图 4）分析，GA与GB在GC-SMEDDS中溶出斜率分别是0.004 0和0.004 6，在原组分中的GA溶出比GB的溶出度好，制备GC-SMEDDS后，GB的释药加速度约是GA的13.04%倍，通过释药加速度的调节，最终使GB与GA的释放量相似度到达96.9%。这说明该系统能够自主调节各成分的释药加速度，使得各成分协同释药。

3 讨论

目前中药口服制剂的释药评价都侧重于提高有效成分的溶出，其目标使得指标成分/有效成分的累积释放率得到一定提高即符合制剂设计的初衷。然而笔者认为，提高中药现代口服制剂首先是确定组分中的成分即基于明确的物质结构上，对其进行制剂设计。其中提高难溶性中药的溶出与难渗透性物质的吸收只是其中一个主要问题，还应该重视制剂中各成分的释药行为。在单组分单元释药中保证成分释药的一致性，协调释药，以期达到相似成分协同起效的目的。

本实验根据GC的生物药剂学性质，利用自乳化可作为疏水性、难吸收、易水解药物的载体的特点，来作为GC的载药形式。SMDDS口服后与胃肠液接触形成载药小乳滴，增加了药物表面积和溶解度^[20-21]，在胃肠道均匀、快速分布。其中乳化剂可降低表面张力，能改变小肠上皮细胞膜的流动性和细胞间紧密连接，以试图增加GC的膜渗透性及改善药物吸收。油相能增加药物在胃肠道中的吸收，低温下不析出药物，遇水易被处方中乳化剂乳化。助乳化剂可辅助溶解药物，助乳化剂分子可嵌入乳化剂分子中，从而共同形成微乳的界面膜，增加界面膜流动性，降低界面膜表面张力及电荷斥力，增加微乳稳定性^[22-23]。

本实验采用伪三元相图法中经典方法加水滴定法研究制备相图。由于GC水溶性差，不易与水形成氢键，处方中药物性质对SMDDS的形成不会产生影响^[15]，因此在处方初步筛选时采用空白伪三元相图来进行试验绘制，确定GC-SMDDS处方中的K_m值。通过稀释不同载药量乳剂，对其外观、粒径、Zeta电位等的测定，确定处方中的油相与混合乳化剂的比例。通过对不同载药量处方的稳定性实验确定最优载药量。

笔者进一步借助f₂相似因子^[18-19]对GC-SMDDS中GA和GB 2种成分的释药行为进行相似度分析，结果表明其释药量相似程度达到96.9%。在通过对2成分释药曲线进行线性回归，进行斜率比较，发现GB的释药加速度比GA多13.04%，可知GC-SMDDS可自行调节GA和GB的释药行为，最终使得两者达到协调释放起效。

目前，大多数中药/复方制剂都是以提高有效成分的溶出或者吸收为直接目的，对中药制剂体外释药的评价也局限于分析其个体指标累积释放率等，很少分析多个成分之间释药的关系，但是作为中药单元组分整体，各释药单元之间释药关系，应根据疾病特点及成分性质、药效基础进行协同调节，各成分释药的表象行为也直接影响制剂整体疗效，因此，本实验为今后中药制剂释药评价提供新思路。