白术Atractylodis Macrocephalae Rhizoma（AMR）为菊科（Compositae）植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，其植物形态为多年生草本，白术性温，气清香，味甘、苦，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎、中和之功效^[1]。白术广泛分布于我国大部分地区，因地理位置和生态环境的不同，茎内的化学成分发生了变异。白术主产于浙江、安徽、湖北、江西等省，多为栽培^[2]。白术的炮制方法较多，有麸炒、土炒、炒焦、炒炭、米泔水漂、蒸制等。据报道，白术中含有多种类型化学成分，如挥发性成分^[3]、内酯类成分^[4-8]、多糖类、苷类^[9-11]、氨基酸^[12]等。由于白术中成分众多，本实验通过对白术的指纹图谱进行研究，以此作为评判白术质量的科学依据之一。

Waters 2695液相色谱系统（在线脱气机、四元泵、自动进样器，美国Waters公司），连接Waters 2998紫外检测器（美国Waters公司）；LC-20AD型快速液相（DGU-20A3型脱气装置，SIL-20A XR型自动进样器，CTO-20AC型柱温箱，日本岛津公司），连接Triple Q-TOF 5600型质谱仪（配备电喷雾离子源系统，美国AB Sciex公司）；AY220电子分析天平（日本岛津公司）；TGL 16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；MUL-9000 Series超纯水系统（美国Millipore公司）；FW100型万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）。

乙腈（批号I698630334，德国Merck公司）；甲醇（批号20140624143，山东禹王实业有限公司化工分公司）为色谱纯；95%乙醇（分析纯，批号14011510093，南京化学试剂有限公司）；水为超纯水（自制）；其余试剂为分析纯。生白术共10批，均购于江阴天江药业有限公司，见表 1。白术内酯I（批号20131109）、白术内酯Ⅲ（批号20131120）均购于中国食品药品检定研究院。

表 1(Table 1)

表 1 样品信息 Table 1 Information of samples 样品编号 产地 批号 1 浙江磐安县安文镇岗头村 1408034 2 浙江磐安县大磐镇小磐村 1404160 3 浙江磐安县大磐镇林丰村 1404161 4 浙江新昌县儒岙镇南山村 1401041 5 安徽亳州 1410142 6 安徽省亳州市谯城区十九里镇 1410012 7 湖南廉桥 1311086 8 湖南郴州 1308017 9 湖北巴东县绿葱城镇 1403148 10 江西上高 1310167

表 1 样品信息 Table 1 Information of samples

色谱柱：Inertsil^® ODS-SP（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温40 ℃，体积流量1.0 mL/min，流动相为乙腈（A）-水（B），洗脱梯度为0～10 min，30%～45% A；10～25 min，45% A；25～50 min，45%～70% A；50～55 min，70% A；55～62 min，70%～30% A；62～75 min，30% A。采用Waters 2998紫外检测器，检测波长235 nm，分析时间75 min，进样量10 μL。

TOF MS-IDA-MS/MS模式，电喷雾离子源（ESI），采用动态背景扣除（DBS）的方法，在正离子检测模式下采集。雾化器电压（GS1）0.38 MPa（55 psi）、辅助加热器电压（GS2）0.38 MPa（55 psi）、气帘气（Curtain Gas）0.25 MPa（36 psi）、辅助加热器温度（TEM）550 ℃，喷雾电压（IS）-5 500 eV，去簇电压（DP）-100 eV、碰撞电压（CE）-40 eV、碰撞电压差15 eV；质量数扫描范围m/z 50～1 500。

精密称取白术内酯I、白术内酯Ⅲ对照品各2 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容至10 mL，各取白术内酯I、白术内酯Ⅲ对照品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容至10 mL，配制成浓度为20.70 μg/mL的白术内酯I及20.10 μg/mL的白术内酯Ⅲ混合对照品溶液。

精密称取白术粗粉0.2 g，置10 mL量瓶中，加入70%甲醇，并定容至10 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）60 min，取出，放冷，用70%甲醇补足减失质量，摇匀。取适量，离心（12 000 r/min）5 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

取适量白术供试液（批号1408034）于比色皿中，得200～400 nm内的PDA扫描图谱。结果发现，白术内酯I、白术内酯Ⅲ在220 nm波长处吸收最强，但色谱信息较少，在235 nm波长处色谱信息最丰富，特征最为明显，图谱中各特征峰信号较强，分离效果较理想。故选择235 nm作为检测波长。

对药材中已知对照品白术内酯I、白术内酯Ⅲ与白术的指纹图谱对照，发现已知峰在指纹图谱中较大，所以选中其中2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰，其保留时间适中14.202 min，占总峰面积4%左右。

精密称取白术粗粉（批号1408034）0.2 g，按“2.4”项下方法制备成供试品溶液，然后按“2.1”项下方法连续进样6次，每次10 μL，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。以白术内酯Ⅲ为参照峰，计算其中6个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2%。

精密称取白术粗粉（批号1408034）0.2 g，按“2.4”项下方法制备成供试品液，然后按“2.1”项下方法每隔3 h进样1次，共测定15 h，分别进样10 μL，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。计算其中6个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2%。

精密称取白术粗粉（批号1408034）0.2 g，平行6份，按“2.4”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”进样10 μL分析，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。计算其中6个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2%。

测定10批不同产地的白术样品的HPLC-PDA图谱，采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”进行结果分析，选择其中共有峰。再以峰2白术内酯Ⅲ为参照峰（即S峰），选择其中相对保留时间和相对峰面积RSD较为稳定（要求不大于5%）的共有峰，作为特征峰，见图 1。依据上述方法，确定白术的指纹图谱中6个特征峰，其中指认出峰2为白术内酯Ⅲ，以峰2为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间应在规定值的±5%之内。规定值为0.16（峰1）、1.00（峰2）、1.56（峰3）、2.06（峰4）、3.28（峰5）、3.54（峰6）。

图 1 白术HPLC-PDA的指纹图谱 Fig.1 HPLC-PDA fingerprint of AMR

精密称取10批不同产地的白术样品粗粉各0.2 g，按“2.4”项下方法制备成供试品溶液，然后按“2.1”项进样10 μL分析，得到白术的指纹图谱，结果见图 2和表 2、3。结果表明，10批不同产地的白术样品中特征峰的相对保留时间稳定，RSD均小于2.0%。

图 2 10批白术HPLC-PDA指纹图谱叠加图 Fig.2 Overlay of ten batches of AMR in HPLC-PDA fingerprint

表 2(Table 2)

表 2 10批白术HPLC-PDA指纹图谱共有峰相对保留时间 Table 2 Relative retention time of common peaks of ten batches of AMR 峰号 相对保留时间 RSD/% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 0.159 0.159 0.159 0.160 0.158 0.158 0.158 0.158 0.158 0.159 0.44 2 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00 3 1.556 1.558 1.556 1.562 1.564 1.563 1.560 1.564 1.565 1.560 0.21 4 2.057 2.058 2.059 2.066 2.076 2.075 2.071 2.076 2.074 2.069 0.37 5 3.284 3.276 3.294 3.300 3.276 3.270 3.259 3.264 3.271 3.249 0.47 6 3.543 3.534 3.555 3.560 3.531 3.525 3.513 3.518 3.527 3.503 0.51

表 2 10批白术HPLC-PDA指纹图谱共有峰相对保留时间 Table 2 Relative retention time of common peaks of ten batches of AMR

表 3(Table 3)

表 3 10批白术HPLC-PDA指纹图谱共有峰相对峰面积 Table 3 Relative peak area of common peaks of ten batches of AMR in HPLC-PDA fingerprint 峰号 相对峰面积 平均值 单峰占总峰面积/% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1.687 1.564 2.425 1.506 1.740 2.989 0.973 1.198 4.538 2.474 2.109 17.430 2 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 8.265 3 0.885 0.739 0.824 0.957 0.981 0.854 0.818 0.788 1.129 1.048 0.902 7.457 4 2.387 2.459 3.363 2.031 2.358 2.571 1.313 0.655 3.208 1.336 2.168 17.920 5 0.393 0.406 0.624 0.390 0.570 0.785 0.239 0.154 0.766 0.368 0.469 3.880 6 3.691 4.874 7.858 4.336 6.389 11.670 2.243 1.812 7.303 4.325 5.450 45.040

表 3 10批白术HPLC-PDA指纹图谱共有峰相对峰面积 Table 3 Relative peak area of common peaks of ten batches of AMR in HPLC-PDA fingerprint

采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”对10批不同产地的白术的指纹图谱进行相似度分析，将10批白术分别与系统中生成的对照谱图（R）进行相似度比较（时间窗宽度0.5），1～10批的相似度分别为0.988、0.994、0.990、0.998、0.991、0.967、0.978、0.950、0.984、0.986，指纹图谱见图 3。结果表明，10批白术与对照图谱的相似度评价结果均大于0.95，说明这10批白术共有物质出峰时间大致相同，质量稳定。

图 3 10批白术HPLC-PDA指纹图谱相似度评价自动匹配图 Fig.3 Automatic matching figure of similarity evaluation of ten batches of AMR in HPLC-PDA fingerprint

采用UFLC-Q-TOF/MS方法对白术进行定性分析，利用Analyst TF 1.6软件采集数据，采用Peak View软件中XIC Manager功能进行目标化合物的筛查和确证（叠加图见图 4）、软件中的Formula finder功能测得化合物相对分子质量，结合特征碎片，再根据UFLC-Q-TOF/MS总离子流图中供试品与对照品保留时间的对照，从而确认白术指纹图谱中的各峰。其正离子模式下UFLC-Q-TOF/MS的总离子流图见图 5、动态扣背景图见图 6，鉴别结果见表 4和表 5。总离子流图中6个化合物的一级、二级质谱图见图 7。

图 4 白术的XIC Manager筛查叠加图 Fig.4 XIC Manager screening overlay of AMR

图 5 白术的正离子模式的总离子流图 Fig.5 TIC with positive ion mode of AMR

图 6 白术的正离子模式总离子的动态图 Fig.6 Dynamic map of positive ion mode of total ion of AMR

1-一级质谱图 2-二级质谱图A-5-羟甲基糠醛B-白术内酯Ⅲ C-白术内酯I D-白术内酯II E-白术内酯VI F-双白术内酯 1-first order mass spectra 2-second order mass spectra A-5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyde B-atractylenolide Ⅲ C-atractylenolide I D-atractylenolide II E-atractylenolide VI F-biatractylenolide 图 7 白术指纹图谱中化合物1～6的质谱图 Fig.7 Mass spectra of compounds 1-6 in fingerprint of AMR

表 4(Table 4)

表 4 白术指纹图谱化学成分的MS/MS分析结果(正离子模式) Table 4 MS/MS analysis of chemical components in fingerprint of AMR (positive ion mode) 峰号 tR/min 二级碎片信息 相对分子质量 分子式 1 2.371 127.039 1 [M+H]+, 109.042 2 [M+H－H2O]+, 97.933 2 [M+H－CH2O]+, 81.936 5 [M+H－H2O－CO]+, 55.936 4 [M+H－H2O－CO－C2H2]+ 126.031 69 C6H6O3 2 13.900 249.149 1 [M+H]+, 231.138 8 [M+H－H2O]+, 213.126 8 [M+H－H2O－H2O]+, 203.142 2 [M+H－H2O－CO]+, 185.132 3 [M+H－H2O－CO－H2O]+, 161.132 6 [M+H－H2O－CO－CH2CO]+, 157.100 7 [M+H－H2O－CO－H2O－C2H4]+, 144.100 6 [M+H－H2O－CO－C3H7O]+, 129.069 8 [M+H－H2O－CO－C3H7O－CH3]+, 119.085 8 [M+H－H2O－CO－CH2CO－C3H6]+, 105.069 9 [M+H－H2O－CO－CH2CO－C4H8]+, 91.055 3 [M+H－H2O－CO－CH2CO－C3H6－C2H4]+, 79.055 9 [M+H－H2O－CO－CH2CO－C4H8－C2H2]+ 248.141 24 C15H20O3 3 22.048 233.153 6 [M+H]+, 215.142 1 [M+H－H2O]+, 187.146 6 [M+H－H2O－CO]+, 145.099 4 [M+H－H2O－CO－C3H6]+, 131.084 2 [M+H－H2O－CO－C3H6－CH2]+, 117.068 9 [M+H－H2O－CO－C3H6－CH2－CH2]+, 105.069 1 [M+H－H2O－CO－C3H6－CH2－C2H2]+, 91.054 0 [M+H－H2O－CO－C3H6－CH2－C2H2－CH2]+, 79.054 4 [M+H－H2O－CO－C3H6－CH2－C2H2－C2H2]+ 232.146 33 C15H20O2 4 31.328 231.137 9 [M+H]+, 213.127 2 [M+H－H2O]+, 185.131 8 [M+H－H2O－CO]+, 157.100 6 [M+H－H2O－CO－C2H4]+, 143.084 9 [M+H－H2O－CO－C2H4－CH2]+, 129.069 4 [M+H－H2O－CO－C2H4－CH2－CH2]+, 128.061 7 [M+H－H2O－CO－C2H4－C2H5]+, 115.054 0 [M+H－H2O－CO－C2H4－CH2－CH2－CH2]+ 230.130 68 C15H18O2 5 48.785 203.179 6 [M+H]+, 161.132 8 [M+H－C3H6]+, 147.116 4 [M+H－C3H6－CH2]+, 133.101 9 [M+H－C3H6－CH2－CH2]+, 119.085 5 [M+H－C3H6－CH2－CH2－CH2]+, 105.070 1 [M+H－C3H6－CH2－CH2－CH2－CH2]+, 91.055 3 [M+H－C3H6－CH2－CH2－CH2－CH2－CH2]+, 79.056 0 [M+H－C3H6－CH2－CH2－CH2－CH2－C2H2]+ 202.172 15 C15H22 6 53.969 463.285 5 [M+H]+, 231.137 9 [M+H－C15H20O2]+, 213.126 4 [M+H－C15H20O2－H2O]+, 185.133 3 [M+H－C15H20O2－H2O－CO]+ 462.277 01 C30H38O4

表 4 白术指纹图谱化学成分的MS/MS分析结果(正离子模式) Table 4 MS/MS analysis of chemical components in fingerprint of AMR (positive ion mode)

表 5(Table 5)

表 5 白术指纹图谱化学成分的UFLC-Q-TOF/MS分析鉴别结果(正离子模式) Table 5 UFLC-Q-TOF/MS analysis of chemical components in fingerprint of AMR (positive ion mode) 峰号 tR/min 化合物 分子式 结构式 [M+H]+/(m/z) 误差/(×10-6) 理论 实际 1 2.371 5-羟甲基糠醛 C6H6O3 127.039 0 127.039 1 0.1 2 13.900 白术内酯Ⅲ C15H20O3 [13] 249.148 5 249.148 9 0.5 3 22.048 白术内酯I C15H20O2 [13] 233.153 6 233.153 6 0.0 4 31.328 白术内酯II C15H18O2 [13] 231.138 0 231.137 9 −0.1 5 48.785 白术内酯VI C15H22 [14] 203.179 4 203.179 6 0.3 6 53.969 双白术内酯 C30H38O4 [15] 463.284 3 463.285 5 1.3

表 5 白术指纹图谱化学成分的UFLC-Q-TOF/MS分析鉴别结果(正离子模式) Table 5 UFLC-Q-TOF/MS analysis of chemical components in fingerprint of AMR (positive ion mode)

以峰2为例，在保留时间为13.900 min时在ESI⁺模式下的一级质谱图中（图 7-B-1），观测到m/z 249.148 9 [M+H]⁺和m/z 231.138 1 [M+H－H₂O]⁺的碎片离子峰，推测m/z 249.148 9 [M+H]⁺为其准分子离子峰。利用Formula finder软件计算其可能的元素组成为C₁₅H₂₀O₃，理论相对分子质量为249.148 5，实测值为249.148 9，误差为0.5×10^-6。二级质谱图（图 7-B-2）中出现249.149 1 [M+H]⁺、231.138 8 [M+H－H₂O]⁺、213.126 8 [M+H－H₂O－H₂O]⁺、203.142 2 [M+H－H₂O－CO]⁺、185.132 3 [M+H－H₂O－CO－H₂O]⁺、161.132 6 [M+H－H₂O－CO－CH₂CO]⁺、157.100 7 [M+H－H₂O－CO－H₂O－C₂H₄]⁺、144.100 6 [M+H－H₂O－CO－C₃H₇O]⁺、129.069 8 [M+H－H₂O－CO－C₃H₇O－CH₃]⁺、119.085 8 [M+H－H₂O－CO－CH₂CO－C₃H₆]⁺、105.069 9 [M+H－H₂O－CO－CH₂CO－C₄H₈]⁺、91.055 3 [M+H－H₂O－CO－CH₂CO－C₃H₆－C₂H₄]⁺、79.055 9 [M+H－H₂O－CO－CH₂CO－C₄H₈－C₂H₂]⁺的碎片离子，推测该化合物为白术内酯Ⅲ。

对提取条件如提取方式（回流、超声）、提取溶剂（甲醇、95%乙醇）、提取溶剂体积分数（30%、50%、70%、90%）、提取时间（30、60、90 min）等进行了考察。综合考虑各个因素，最终确定提取方式为超声、提取溶剂为70%甲醇和提取时间为60 min。

采用HPLC-PDA，考察了多个C₁₈键合硅胶色谱柱：Inertsil^® ODS-SP（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Hedera ODS-3（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex^® ODS C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），结果表明Inertsil^® ODS-SP（150 mm×4.6 mm，5 μm）能够较好地分离各色谱峰，出峰时间比较适当，分离度好。

考察了乙腈-水和甲醇-水2种流动相体系对白术的检测，结果发现，乙腈-水系统分离得到对称性较佳的色谱峰，具有更好的分离效果。同时，采用梯度洗脱，考察了不同配比的流动相对白术中各化学成分的分离情况。

另外，分别对色谱条件如柱温（38、40、42 ℃）、体积流量（0.9、1.0、1.1 mL/min）、仪器（Waters 2695和Agilent 1260高效液相色谱系统）等进行了考察。综合考虑各个因素，确定了最终的色谱条件。

一般采用传统的TLC法对其定性和HPLC法对其进行定量测定，笔者更倾向于采用中药指纹图谱对中药饮片和产品进行整体的把控，从源头评价中药饮片的真实性、均一性。本研究建立了白术的HPLC指纹图谱，共标定了6个共有指纹峰，并利用高分辨UFLC-Q-TOF/MS方法对共有峰进行了定性鉴别，明确了6个共有峰的化学成分，分别为5-羟甲基糠醛、白术内酯Ⅲ、白术内酯I、白术内酯II、白术内酯VI和双白术内酯。方法简便易行且稳定可靠、重复性较好。采用相似度对指纹图谱进行评价，不同批次相似度较好，均大于0.95，说明不同产地（浙江、安徽和湖南等省）、不同批次白术的化学组成一致性较好。将指纹图谱用于生产过程，可为该产品提供更为全面的质量控制手段。若能在此基础上发展，和临床剂量与药效或毒性联系起来，则能从源头开始保证临床用药的安全有效性，对科研与生产实践的结合具有重要的指导意义。