重芪结肠靶向微丸是针对结肠癌患者便血、腹泻、局部疼痛、肠道菌群失衡常见症状^[1]，选用重楼、黄芪精制而成的中药新制剂，方小力专、疗效确切、服用方便。方中重楼Paridis Rhizoma具有较强的止血、镇痛作用，并可诱导肿瘤细胞凋亡^[2-4]及抑菌作用^[5]；黄芪Astragali Radix可显著提高机体免疫力，发挥抗肿瘤作用，同时可平衡结肠癌肠道微生态菌群结构^[6-7]。结肠靶向给药可有效避免肝、胃肠道的首关效应，提高结肠局部药物浓度，提高药效，同时微丸剂型体积较小，药物在肠道内表面分布面积大，转运时间长，有利于药物吸收，发挥长效作用，本研究制备重芪结肠靶向微丸，为临床结肠癌的防治提供新思路和新选择。

HJ-400-P挤出-滚圆制丸机，重庆荣凯机械制造有限公司；WBF-1型多功能流化床，重庆英格制药机械有限公司；Aglient 1260型高效液相色谱仪，安捷Agilent有限公司；AB135-S型电子天平，Mettler Toledo公司；ZB-1C智能溶出试验仪，天津大学精密仪器厂。

对照品重楼皂苷Ⅰ（批号111590-200402，质量分数92.1%）、重楼皂苷Ⅱ（批号111591-200402，质量分数93.4%），均购自中国食品药品检定研究院；微晶纤维素（MCC），台湾名台公司；糊精，海盐六合药业有限公司；重楼总皂苷-羟丙基环糊精包合物，总皂苷45.5%，重楼皂苷Ⅰ 15.6%，重楼皂苷Ⅱ 14.6%，自制；黄芪总多糖，总多糖61.3%，自制；Eudrugit S100、Eudrugit L100、Eudrugit L100-55，德国Rohm公司；滑石粉，上海昌为医药辅料技术有限公司；单硬脂酸甘油酯，北京华威锐科化工有限公司；柠檬酸三乙酯（TEC），上海迈瑞尔化学技术有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS），湖南尔康制药有限公司；乙腈和磷酸溶液为色谱纯；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。

取50% MCC、20%糊精、30%重楼和黄芪有效部位（1:2）混合物，以85%乙醇为黏合剂，制备软材。

结果可知，B、C因素为显著因素（B＞C），A为不显著性因素，从提高效率角度考虑，A因素可选择水平3，C因素可选择水平2，综合直观分析和方差分析结果，拟定A₃B₂C₂为最佳提取工艺，即挤出速率为60 r/min，滚圆速度为1 200 r/min，滚圆时间为5 min。

表 1(Table 1)

表 1 正交试验设计及结果 Table 1 Design and results of orthogonal test 试验号 A/(r∙min−1) B/(r∙min−1) C/min D (空白) 微丸收率/% 1 40 (1) 900 (1) 3 (1) (1) 32.3 2 40 (1) 1 200 (2) 5 (2) (2) 75.8 3 40 (1) 1 500 (3) 7 (3) (3) 76.7 4 50 (2) 900 (1) 5 (2) (3) 55.7 5 50 (2) 1 200 (2) 7 (3) (1) 86.2 6 50 (2) 1 500 (3) 3 (1) (2) 63.5 7 60 (3) 900 (1) 7 (3) (2) 61.8 8 60 (3) 1 200 (2) 3 (1) (3) 75.2 9 60 (3) 1 500 (3) 5 (2) (1) 77.1 K1 184.80 149.80 171.00 195.60 K2 205.40 237.20 208.60 201.10 K3 214.10 217.30 224.70 207.60 R 29.30 87.40 53.70 12.00

表 1 正交试验设计及结果 Table 1 Design and results of orthogonal test

表 2(Table 2)

表 2 方差分析 Table 2 Analysis of variance 方差来源 离差平方和 自由度 F值 显著性 A 150.95 2 6.28 B 1 399.00 2 58.16 P＜0.05 C 506.30 2 21.05 P＜0.05 D (误差) 24.06 2

表 2 方差分析 Table 2 Analysis of variance

取载药微丸适量，置于流化床底喷包衣锅中，风机频率25 Hz，进风温度40 ℃，喷液速度2 m/min，喷枪压力0.7 MPa。包衣结束后40 ℃继续干燥5 min，微丸相互间不黏连，将微丸从流化床内取出，即得。

采用Kromasil C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（48:52）为流动相；检测波长为203 nm，体积流量1.0 mL/min；柱温40 ℃。理论板数按重楼皂苷Ⅰ峰计算应不低于4 000。

取重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度均为0.4 mg/mL的混合对照品溶液，即得。

取微丸适量，研细，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，以甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按微丸制备工艺、处方比例，不加重楼总皂苷有效部位，制得模拟制剂，按供试品溶液的制备方法制备样品，即得。

精密吸取对照品溶液、供试品溶液及空白样品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，供试品中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ色谱峰能达到分离，且保留时间与对照品一致；空白样品溶液无干扰，见图 1。

图 1 混合对照品(A)、样品(B)及空白样品(C) HPLC图 Fig.1 HPLC of mixed reference solution (A), sample solution (B), and black samples (C)

按《中国药典》2015年版四部通则0931第一法进行试验，取适量微丸装于普通胶囊壳中，分别依次测定其在人工胃液（pH 1.2的稀盐酸）2 h、人工肠液（pH 6.8的磷酸缓冲液）4 h、人工结肠液（pH 7.6的磷酸缓冲液）2 h中的释放情况。转速为100 r/min，介质温度为（37.0±0.5）℃，于规定时间（在人工胃液中分别于10、30、60、90、120 min取样，人工肠液中分别于30、60、120、240 min取样，人工结肠液中分别于10、20、30、60、90、120 min取样）取释放液5 mL，并迅速补充等体积等温度的溶出介质，滤过，测定重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ的量，计算药物的累积释放度（RR）^[10]。

C_n为第n次取样时释放介质中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的质量浓度之和，V为释放介质的体积，V′为第n次取样前的取样体积，W为微丸中所能释放的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ质量总和

参考相关文献方法^[11]，分别配制3种常用的包衣液：称取Eudragit S100、Eudragit L100、Eudragit L100-55各10 g，分别缓慢加至100 mL 95%乙醇溶液中，搅拌溶解，将5% TEC、1.5%单硬脂酸甘油酯加至上述95%乙醇溶液中，继续搅拌分散均匀，过50目筛，即得。分别用以上3种包衣液进行包衣，包衣增重20%，测定RR，结果见表 3，绘制释药曲线，结果见图 2。结果表明，Eudragit S100、Eudragit L100、Eudragit L100-55 3种包衣材料在2 h内（人工胃液中）几乎不释放，在人工肠液4 h的RR分别为6.12%、78.56%、85.47%，在人工结肠液2 h的RR分别为96.31%、95.86%、96.52%。因此选用Eudragit S100为结肠包衣材料。

表 3(Table 3)

表 3 不同包衣材料的RR测定结果(x±s, n=3) Table 3 Cumulative release rate of coated pellets with different coating materials (x±s, n=3) 包衣材料 RR/% 人工胃液 人工肠液 人工结肠液 Eudragit S100 0.015±0.002 6.12±0.77 96.31±0.23 Eudragit L100 0.024±0.003 78.56±1.23 95.86±1.55 Eudragit L100-55 0.022±0.001 85.47±2.14 96.52±2.01

表 3 不同包衣材料的RR测定结果(x±s, n=3) Table 3 Cumulative release rate of coated pellets with different coating materials (x±s, n=3)

图 2 不同包衣材料的释药曲线(n=3) Fig.2 Release curves of coated pellets with different coating materials (n=3)

分别选取10%、15%、20% 3种包衣增重量对微丸进行包衣，测定RR，结果见表 4，绘制释药曲线，结果见图 3。结果表明，包衣增重15%和20%释药曲线符合结肠靶向释药的要求，为提高效率，节省物料，选择包衣增重为15%。

表 4(Table 4)

表 4 不同包衣增重的RR测定结果(x±s, n=3) Table 4 Cumulative release rate of coated pellets with different weight gains in coating levels (x±s, n=3) 包衣增重/% RR/% 人工胃液 人工肠液 人工结肠液 10 0.025±0.003 25.34±0.90 96.92±0.41 15 0.016±0.004 9.50±0.36 95.29±2.05 20 0.011±0.001 7.55±1.01 96.02±1.11

表 4 不同包衣增重的RR测定结果(x±s, n=3) Table 4 Cumulative release rate of coated pellets with different weight gains in coating levels (x±s, n=3)

图 3 不同包衣增重的释药曲线 Fig.3 Release curves of coated pellets with different weight gains in coating levels

分别以含3%、5%、7% TEC的包衣液对微丸进行包衣，观察形成的衣膜是否光滑完整，并测定RR，结果见表 5，绘制释药曲线，结果见图 4。观察不同TEC用量包衣所得微丸，5%、7%用量所得微丸衣膜光滑完整，由释药曲线可知，5%、7% TEC用量符合结肠靶向释药的要求，为节省物料，选择TEC用量为5%。

表 5(Table 5)

表 5 不同TEC用量的RR测定结果(x±s, n=3) Table 5 Cumulative release rate of coated pellets with different amounts of TEC (x±s, n=3) TEC用量/% RR/% 人工胃液 人工肠液 人工结肠液 3 0.023±0.005 14.53±1.32 96.11±0.99 5 0.015±0.001 9.50±0.36 95.29±2.05 7 0.010±0.003 8.95±2.16 95.78±0.27

表 5 不同TEC用量的RR测定结果(x±s, n=3) Table 5 Cumulative release rate of coated pellets with different amounts of TEC (x±s, n=3)

图 4 不同TEC用量的释药曲线 Fig.4 Release curves of coated pellets with different amounts of TEC

分别以含0.5%、1.0%、1.5%单硬脂酸甘油酯的包衣液对微丸进行包衣，观察包衣过程中微丸是否发生粘连。结果在包衣过程中，0.5%、1.0%单硬脂酸甘油酯用量包衣微丸有粘连现象，1.5%的单硬脂酸甘油酯用量微丸包衣无粘连现象，因此选用抗黏剂单硬脂酸甘油酯的用量为1.5%。

按确定的制备工艺及包衣处方制备3批样品，测定微丸收率及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ的量，结果见表 6。测定RR，绘制释药曲线，结果见图 5。由图可知，结果3批微丸释药曲线均符合结肠靶向释药要求，表明3批微丸制备工艺稳定可行，具有良好的体外结肠释药特征。

表 6(Table 6)

表 6 3批结肠靶向微丸收率及定量测定结果(x±s, n=3) Table 6 Yield and contents of PRS I and II of colon-specificpellets with same membrane coating (x±s, n=3) 批号 微丸收率/% 重楼皂苷Ⅰ/% 重楼皂苷Ⅱ/% 20160314 85.70±0.16 1.046±0.200 1.021±0.360 20160318 86.10±1.21 1.042±0.890 1.019±0.450 20160320 85.50±1.01 1.044±0.770 1.020±0.780

表 6 3批结肠靶向微丸收率及定量测定结果(x±s, n=3) Table 6 Yield and contents of PRS I and II of colon-specificpellets with same membrane coating (x±s, n=3)

图 5 3批结肠靶向微丸的释药曲线(n=3) Fig.5 Release curves of three batches of colon-specific pellets with same membrane coating (n=3)

本实验采用挤出-滚圆-流化床法包衣制备重芪结肠靶向微丸。实验结果表明，以Eudrugit S100为包衣材料，以1.5%单硬脂酸甘油酯为抗黏剂，5%柠檬酸三乙酯为增塑剂，包衣增重15%，制备的微丸在人工胃液中2 h几乎无药物释放，在人工肠液中4 h RR＜10%，在人工结肠液中2 h RR＞90%，显示出所制备的重芪结肠靶向微丸具有良好的结肠靶向性，本研究后期还将进一步考察其在体内的结肠释药特性。

重楼总皂苷水溶性较差，直接制成微丸后药物难以释放，影响释放度的测定，因此本研究前期对重楼总皂苷进行了聚乙二醇分散、羟丙基环糊精包合等研究，最终选择重楼总皂苷-羟丙基环糊精作为原料进行微丸的制备。微丸制备常用MCC、粉状纤维素、玉米芯粉、糊精、淀粉、乳糖等辅料，由于本微丸含有黏性较大的黄芪多糖成分，经预试验选用MCC和糊精作为制剂辅料，同时结合给药剂量和成型工艺，当药物-MCC-糊精质量比例为3:5:2时，制备的软材能被顺利挤出，微丸收率高。

滑石粉为微丸包衣常用的抗黏剂，但其容易导致微丸包衣膜不均匀，且容易阻塞流化床喷液枪头，本实验前期对抗黏剂滑石粉、单硬脂酸甘油酯、微粉硅胶的等进行了筛选，最终选定用量较少、抗黏效果较好的单硬脂酸甘油酯为抗黏剂。

针对结肠癌患者灌肠、栓剂给药方式不易接受，给药不方便的弊端，本研究精选临床常用抗肿瘤中药重楼、黄芪，经精制制备结肠靶向口服制剂，方小力专、服用方便、便于患者长期用药。

常见的结肠靶向给药类型主要有时间控制型、pH依赖型、细菌降解型（酶型）等，由于时间依赖型易受食物影响，本研究未涉及。由于本制剂的定位为轻中度结肠癌的辅助治疗，考虑到癌症病理状态下，结肠内肠道菌群处于失衡状态，对细菌降解型（酶型）制剂药物的释放可能会产生一定的影响，因此，本研究制备适应性较好的pH依赖型结肠靶向制剂，以发挥更好的结肠癌治疗作用。