2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.18.009 |
质量源于设计（Quality by design，QbD）是当前国际制药领域的先进理念，强调通过了解制药过程保障药品质量[1-2]。这必然要求明确各制药工艺对药品质量的可能影响，具体内容包括：确定关键生产工艺，辨识关键工艺参数，获得关键工艺参数和药品或中间体质量的定量关系等。其中，辨识关键工艺参数能明确药品制造过程中重点控制的目标参数，对于实施QbD理念至关重要[3-4]。
常用的关键工艺参数辨识方法包括：多元线性回归法、标准偏回归系数法[5]、逐步回归法、敏感性分析法[6]和失效模式和效果分析法[7]等。其中，多元线性回归法需要建立工艺参数和工艺评价指标间的多项式模型，比较模型中各项系数的统计检验P值和预设阈值的相对大小确定关键参数。该法已用于辨识醇沉[8]和水沉[9]等工艺的关键参数。标准偏回归系数法需计算各参数对应各工艺评价指标的标准偏回归系数绝对值并求和，和值较大的参数更可能是关键参数。目前该法已用于确定醇沉工艺关键参数[10]。逐步回归法通过设定移入和移出项的阈值，在建立多元线性模型时直接将关键工艺参数对应的项保留于模型中。该法已用于辨识中药浓缩液关键质控指标[11-12]。
黄芩Scutellariae Radix是唇形科黄芩属植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效[13-14]。黄酮类化合物为黄芩主要有效成分[15-16]，包括野黄芩苷、黄芩苷和汉黄芩苷等。黄芩提取物收录于《中国药典》2015年版，用于制备银黄口服液、痰热清注射液、茵栀黄软胶囊等多种中成药。其制法一般采用酸沉碱溶工艺：水提黄芩后调酸沉淀，然后取沉淀并用碱液复溶。目前对酸沉碱溶工艺的研究很少，其关键工艺参数仍然不明。
本实验将以黄芩水提液酸沉碱溶工艺的关键参数辨识为例，比较多元线性回归法、逐步回归法和标准偏回归系数法，讨论各方法特点，为其他中药生产工艺关键参数辨识提供参考。
1 仪器与材料DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；S40 pH计、AB204-N精密电子天平，德国Mettler-Toledo公司；J-26XPI高速离心机，美国Beckman Coulter公司；THD-1008W低温恒温槽，宁波天恒仪器厂；ZCY-15B恒温槽，宁波天恒仪器厂；GM-1.0A隔膜真空泵，天津津腾实验设备有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪，Agilent科技有限公司，配四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、ChemStation工作站。
对照品野黄芩苷（批号130617，质量分数99.43%）、黄芩苷（批号130609，质量分数99.23%）和汉黄芩苷（批号130603，质量分数99.39%）均购自上海融禾医药科技有限公司；乙腈，色谱纯，默克股份两合公司；纯净水，浙江娃哈哈实业股份有限公司；纯化水，由Milli-Q Synthesis水纯化系统（德国Millipore公司）制得；甲醇，色谱纯，默克股份两合公司；磷酸，色谱纯，Fluka Analytical；氢氧化钠、无水乙醇，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；盐酸，优级纯，国药集团化学试剂有限公司。黄芩药材来自上海凯宝药业股份有限公司，经浙江大学药学院李文龙博士鉴定为唇形科黄芩属植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。
2 方法与结果 2.1 黄芩水提液的制备黄芩药材置于烘箱内以55 ℃干燥至恒定质量后，称取290 g置于5 L圆底烧瓶中，然后加入1.6 L沸腾的纯净水开始提取。加热回流提取1.0 h后滤过取滤液。再用1.2 L沸腾的纯净水第2次提取，加热回流提取0.5 h后滤过取滤液。合并2次滤液后离心，称质量后测定其中野黄芩苷、黄芩苷和汉黄芩苷的量。
2.2 酸沉碱溶精制将黄芩水提液稀释至实验所需质量分数，加盐酸溶液调低pH值后，在预设温度下保温一定时间。保温结束后取出样品并置于低温恒温槽中静置一定时间后，抽滤得到沉淀物。加沉淀物8倍量的水混悬，用10% NaOH溶液调pH值，再加等量乙醇，搅拌溶解。收集滤液称质量后测定其中野黄芩苷、黄芩苷和汉黄芩苷的量。
2.3 分析方法采用HPLC法测定黄芩水提液和酸沉碱溶滤液中野黄芩苷、黄芩苷和汉黄芩苷的量[17]。分析条件：色谱柱为Waters Atlantis-T3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.03%磷酸水溶液为流动相A，0.03%磷酸乙腈溶液为流动相B，进行梯度洗脱：0～15 min，5%～20% B；15～25 min，20% B；25～45 min，20%～45% B；45～46 min，45%～90% B；检测波长335 nm（野黄芩苷）、280 nm（黄芩苷和汉黄芩苷）；体积流量1 mL/min；进样量5 μL；柱温40 ℃。
2.4 部分因子实验设计及评价指标的确定本研究采用7因素2水平的部分因子实验设计，考察药液质量分数（A，以生药质量分数表示）、酸沉pH值（B）、保温温度（C）、保温时间（D）、静置温度（E）、静置时间（F）和碱溶pH值（G）7个参数对黄芩水提液酸沉碱溶工艺精制效果的影响。表 1中列出的部分因子实验设计由Design-Expert软件（Version 8.0，美国Stat-Ease公司）产生。各因素的高低水平结合工业生产经验设定，也列于表 1中。工艺评价指标为野黄芩苷、黄芩苷和汉黄芩苷保留率。
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表 1 部分因子实验条件及结果 Table 1 Fractional factorial designed experiments and results |
从表 1可知，野黄芩苷保留率在9.1%～55.8%，黄芩苷保留率在18.6%～92.0%，汉黄芩苷保留率在6.3%～81.3%，说明这3种活性成分在酸沉碱溶工艺中存在明显损失。有文献报道野黄芩苷和黄芩苷在强酸或强碱条件均易降解[18-19]。
2.5 3种关键工艺参数辨识方法比较辨识关键工艺参数时采用3种不同方法。
2.5.1 多元线性回归法对于多元线性回归法，采用公式（1）建立工艺评价指标和工艺参数的定量模型。关键工艺参数对应的偏回归系数检验P值应小于或等于预设P值阈值。
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(1) |
其中Y为工艺评价指标实际值，a0为常数项，ai为偏回归系数，Xi为工艺参数的编码值
采用公式（1）建立工艺参数与工艺评价指标间的模型，模型决定系数（R2）及各项P值列于表 2。各模型R2在0.83～0.87，说明数据中大部分变异均能被当前模型解释。P值较小意味着对应工艺参数为关键参数的可能性较大。对于不同工艺评价指标，相应的关键参数有可能不同。改变P值的阈值为0.05、0.10、0.15，所得关键参数列于表 3。当P值阈值为0.05和0.10时，关键参数为药液质量分数、酸沉pH值和碱溶pH值。当P值阈值为0.15时，静置温度也被判断为关键参数。
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表 2 多元线性回归模型中的偏回归系数、P值与R2值 Table 2 Partial regression coefficients, P values, and R2 values of multivariate linear regression models |
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表 3 不同筛选方法所得关键工艺参数 Table 3 Critical process parameters selected using different methods |
2.5.2 逐步回归法
对于逐步回归法，在公式（1）的基础上将移入或移出特定项的P值分别设定为0.05、0.10、0.15。最终模型中各项对应的参数为关键工艺参数。在不同移入和移出项P值时所得模型系数、R2及相应偏回归系数值见表 4。各模型R2在0.75～0.83，说明模型中保留的项能解释数据大部分变异。对于野黄芩苷保留率和黄芩苷保留率，当P值为0.05、0.10、0.15时，所得结果完全相同。对于汉黄芩苷保留率，当P值提高到0.15时，模型中的项数以及模型R2均增加。不同P值时所得关键工艺参数见表 3。当移入和移出项P值为0.05和0.10时，关键参数为药液质量分数、酸沉pH值和碱溶pH值。当移入和移出项P值为0.15时，关键参数包括静置温度。
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表 4 逐步回归模型中的偏回归系数、R2和P值 Table 4 Partial regression coefficients, R2 values, and P values of stepwise regression models |
2.5.3 标准偏回归系数法
对于标准偏回归系数法。首先对各个关键工艺评价指标采用公式（2）进行标准化处理，然后通过多元线性回归建立工艺参数和指标的定量模型，多元线性回归模型见公式（3），然后将各偏回归系数的绝对值相加，加和值大于阈值的项对应参数为关键参数。多元线性回归和逐步回归计算均由Design-Expert 8.0软件完成。
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(2) |
其中Y为工艺评价指标标准化后的值，Y为工艺评价指标平均值，s为工艺评价指标标准差
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(3) |
其中b0为常数项，bi为偏回归系数
对表 1中各个关键工艺评价指标以公式（2）进行标准化，用多元线性回归方程进行拟合，获得模型的决定系数及偏回归系数结果见表 5。偏回归系数绝对值大小反映了工艺参数对各指标的影响程度。将其加和后可以获得某工艺参数对多个指标的综合影响。选择不同阈值可能获得不同关键工艺参数，表 3中列出了一些可能的阈值及所得关键参数。由表 3可知，阈值越低，所得的关键工艺参数越多。
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表 5 标准偏回归系数模型R2、偏回归系数及其绝对值之和 Table 5 Partial regression coefficients, sums of their absolute values, and model R2 values obtained using Equation 3 |
3 讨论
3种方法的共同点是都使用了线性回归，建模时没有平方项和交叉项，所以不能体现出工艺参数的非线性作用和交互作用。3种方法的阈值选择对最终得到的关键工艺参数都可能有较大影响。前2种方法中P值阈值设得越小，或者第3种方法中标准偏回归系数绝对值之和阈值越大，得到的关键工艺参数数量越少。3种方法的阈值选择都有一定主观性。当实验数据量较多时，分析结果的可靠性较高，可以考虑设定更严格的阈值。本实验3种方法所得结果基本一致，可以认为药液质量分数、酸沉pH值、碱溶pH值和静置温度是黄芩酸沉碱溶工艺的关键参数。
比较表 2和表 4可知，逐步回归法所得模型中各项的P值均小于多元线性回归法所得模型中相应项的P值。其原因在于逐步回归法建模时会删去部分不重要的项，这能使保留在模型中的项更为显著。所以逐步回归法比多元线性回归法更敏感，有可能在P值阈值相同的情况下辨识出更多关键参数。多元线性回归法和逐步回归法均考察某个参数对某个指标的影响是否显著，而标准偏回归系数法的优点在于能体现出某个参数对所有评价指标的综合影响。如果各个指标之间的权重不同，那么在计算标准偏回归系数绝对值之和时也很容易相应进行加权。当工艺评价指标数量较多时，建议采用标准偏回归系数法。
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