糖尿病是由于胰岛素分泌绝对或相对不足引起的以高血糖为主要特征的代谢障碍性疾病。持续高血糖一方面可引起多种并发症，另一方面可直接损伤胰岛β细胞，导致胰岛素分泌进一步减少，此即葡萄糖毒性作用。临床资料显示，由于受饮食、用药等多种因素影响，糖尿病患者常出现明显血糖波动，表现为餐后高血糖及使用降糖药后出现的低血糖^[1]。大量研究表明，血糖波动较持续性高血糖更易诱导胰岛细胞损伤，加重胰岛功能障碍^[2]，且血糖波动幅度越大，糖尿病预后越差^[3]。这些结果显示，抑制血糖波动诱导的胰岛细胞损伤，可能是保护胰岛功能、改善糖尿病预后的有效措施之一。

丹酚酸B（Sal B）是从唇形科植物丹参中提取的水溶性成分，具有较强的抗氧化活性，对心、脑及血管内皮等均具有明显保护作用^[4]。既往研究表明，丹酚酸B可显著降低糖尿病动物血糖水平^[5-6]，但其确切机制尚未明确。本研究采用高糖高脂饮食合并ip链脲佐菌素（STZ）的方法建立大鼠糖尿病模型，并在此基础上错时给予胰岛素或葡萄糖建立更符合临床特点的糖尿病血糖波动模型，观察丹酚酸B对糖尿病大鼠胰岛功能的影响，并探讨其可能的作用机制，为临床应用丹酚酸B防治糖尿病提供依据。

健康雄性SD大鼠80只（SPF级），体质量220～240 g，购于浙江省实验动物中心，许可证号SCXK（浙）2014-0001。高糖高脂饲料购自南京市青龙山实验动物中心，含猪油10%、蔗糖10%、蛋黄粉5%、胆固醇1%、普通饲料74%。

丹酚酸B，质量分数80%，批号HK201410，西安文竹生物科技有限公司；STZ，美国Sigma公司；血糖仪、血糖试纸，长沙三诺生物传感技术有限公司；普通胰岛素，江苏万邦生化医药股份有限公司，批号201410。大鼠胰岛素（INS）酶联免疫检测试剂盒，上海朗顿生物技术有限公司；糖化血红蛋白（GHb）测试盒，南京建成生物工程研究所；TUNEL检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；胰十二指肠同源盒1（PDX-1）抗体，CST公司；β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记二抗、总抗氧化能力（TAC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、蛋白定量试剂盒均购于碧云天生物技术研究所；其余试剂均为分析纯。

5427R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；DNM-9602型酶标仪，北京普朗新技术有限公司；BX-41型奥林巴斯显微镜，日本Olympus公司；PowerPac300型电泳仪、Mini PROTEAN转膜系统，美国Bio Rad公司；FluorChem FC3化学发光凝胶成像系统，美国ProteinSimple公司。

健康雄性SD大鼠80只，饲养温度（22±2）℃，湿度60%～65%，光照周期12 h，自由进食及饮水。适应性喂养1周后，随机选取10只作对照组，喂以普通饲料，其余大鼠给予高糖高脂饲料。4周后，禁食12 h，按40 mg/kg一次性ip STZ（STZ溶于滤过除菌的0.1 mol/L pH 4.5的柠檬酸缓冲液，配成1%的溶液），注射STZ 72 h后尾静脉取血测其空腹血糖（血糖仪最大血糖显示值为27.8 mmol/L，超出量程仪器显示为High，这种情况血糖值被认为是27.8 mmol/L），造模7 d待血糖稳定后以随机血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为模型组、丹酚酸B高剂量（160 mg/kg）组及丹酚酸B低剂量（80 mg/kg）组。模型组和丹酚酸B各组继续喂饲高脂饲料，并于每日8:00及18:00检测血糖值，并根据血糖水平，选择sc普通胰岛素3～9 U（随机血糖≥16.7 mmol/L）或ig葡萄糖2 g/kg（随机血糖＜16.7 mmol/L），造成1 d之内血糖水平大幅度波动模型。丹酚酸B各组同时ig给予丹酚酸B 160和80 mg/kg，连续6周。实验过程中每周称体质量1次，并根据体质量调整给药剂量。

在给予胰岛素或葡萄糖诱导血糖波动后，每周二分别于8:00、10:00、16:00、18:00和20:00测定大鼠随机血糖水平，描绘大鼠1 d内5个时间点血糖波动趋势。各组大鼠分别于给药0、2、4、6周检测空腹血糖（FBG)。

末次给药后，大鼠禁食12 h，尾静脉取血测其空腹血糖。ip戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，腹主动脉取血后分离血清，按试剂盒说明书检测大鼠空腹胰岛素（FINS）、TAC、SOD活性及MDA水平，留取部分全血分离红细胞制备溶血液，检测大鼠GHb水平。

取胰尾组织，多聚甲醛固定，常规石蜡切片（5 μm），HE染色观察病理学改变。TUNEL染色按试剂盒说明书进行操作，以细胞核为深棕色判断为凋亡细胞，每只大鼠染色切片随机选取5个区域进行拍照分析，用Image-pro plus图像分析软件分析胰岛细胞凋亡水平，以5个视野平均凋亡率作为每只大鼠胰岛细胞凋亡率。

取胰腺组织，用PBS制成10%组织匀浆，按试剂盒说明书测定TAC、SOD活性及MDA水平，BCA法测定蛋白浓度。

取胰腺组织，RIPA裂解液裂解组织，12 000×g、4 ℃离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白，转膜、封闭后加入PDX-1和β-actin抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，ECL发光显色，凝胶图像分析仪分析目的条带吸光度值，结果以PDX-1与β-actin条带吸光度比值表示。

采用DAS 1.0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD法。

图 1所示为建立血糖波动模型第1周日内随机血糖波动情况。对照组大鼠5个检测时间点血糖水平基本稳定，日内血糖水平无明显波动。与之相反，糖尿病造模大鼠在各时间点血糖水平均显著高于对照组。由于在8:00和18:00分别注射了胰岛素，糖尿病大鼠10:00和20:00血糖水平较其他时间点出现明显下降，这些结果提示，糖尿病大鼠血糖波动模型建立成功。

图 1 糖尿病大鼠1 d内5个时间点血糖变化趋势(x±s, n=10) Fig.1 Intraday variation of blood glucose in diabetic rats in five time points for 1 d (x±s, n=10)

由图 2可见，糖尿病大鼠FBG水平在整个实验过程中均显著高于对照组（P＜0.01），提示大鼠已形成稳定的糖尿病模型。给予丹酚酸B治疗后，糖尿病大鼠FBG出现下降趋势，至实验结束时其水平显著低于模型组（P＜0.05、0.01），提示丹酚酸B可明显降低糖尿病血糖波动模型大鼠FBG水平。

与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group, same as below 图 2 丹酚酸B对糖尿病大鼠FBG的影响(x±s, n=10) Fig.2 Effect of Sal B on FBG in diabetic rats (x±s, n=10)

与对照组比较，模型组大鼠GHb水平明显升高，FINS水平显著降低（P＜0.01）。给予丹酚酸Ｂ后大鼠GHb水平明显下降，而FINS水平显著升高（P＜0.05），见表 1，提示丹酚酸B可明显改善糖尿病血糖波动模型大鼠胰岛功能。

表 1(Table 1)

表 1 丹酚酸B对大鼠FINS和GHb的影响(x±s, n=10) Table 1 Effect of Sal B on FINS and GHb levels (x±s, n=10) 组别 剂量/(mg·kg−1) FINS /(μU·mL−1) GHb/(吸光度值·10 g−1) 对照 — 20.20±2.83 25.57±3.35 模型 — 10.70±1.96** 55.03±12.41** Sal B 160 15.34±3.38# 39.38±9.89# Ssl B 80 13.39±1.62# 41.46±6.44#

表 1 丹酚酸B对大鼠FINS和GHb的影响(x±s, n=10) Table 1 Effect of Sal B on FINS and GHb levels (x±s, n=10)

由图 3可见，对照组大鼠胰腺内胰小叶密集，胰岛呈圆形，边界清晰，细胞核大而圆，胰岛内细胞数量较多，形状规则，排列整齐，分布均匀。而模型组大鼠胰岛数量明显减少，边界模糊，分布稀疏，纤维增生，胰岛细胞肿胀、坏死，细胞核固缩，细胞内有大量炎症细胞浸润，破坏严重。丹酚酸B各组胰岛细胞明显增多，胰岛体积增大，胰岛细胞形态较模型组明显改善，提示丹酚酸B对糖尿病大鼠胰岛细胞具有明显的保护作用。

图 3 丹酚酸B对大鼠胰岛病理改变的影响 Fig.3 Effect of Sal B on pathological changes in pancreatic tissues of diabetic rats

由图 4可见，对照组大鼠胰岛细胞很少出现凋亡，而模型组大鼠胰岛内出现大量凋亡细胞，细胞凋亡率较对照组明显升高（P＜0.01），给予丹酚酸B后胰岛细胞凋亡率显著降低（P＜0.05、0.01），提示丹酚酸B可有效抑制糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡。

图 4 丹酚酸B对大鼠胰岛细胞凋亡的影响 Fig.4 Effect of Sal B on pancreatic islet cell apoptosis in diabetic rats

与对照组比较，模型组大鼠血清及胰腺组织中TAC、SOD活性均显著降低，MDA水平明显升高（P＜0.01），给予丹酚酸B可明显提高大鼠血清及胰腺组织TAC、SOD活性，降低MDA水平（P＜0.05、0.01），提示丹酚酸B可明显改善糖尿病大鼠氧化应激状态，见表 2和3。

表 2(Table 2)

表 2 丹酚酸B对大鼠血清TAC、SOD活性及MDA水平的影响(x±s, n=10) Table 2 Effect of Sal B on levels of TAC, SOD, and MDA in serum of rats(x±s, n=10) 组别 剂量/(mg·kg−1) TAC/(mmol∙L−1) SOD/(U∙mL−1) MDA/(nmol∙mL−1) 对照 — 0.70±0.04 84.64±24.52 21.69±5.57 模型 — 0.35±0.10** 35.57±6.08** 49.09±9.89** Sal B 160 0.58±0.07## 52.64±9.83## 29.31±5.21## Ssl B 80 0.57±0.07## 51.92±13.99# 34.29±9.23#

表 2 丹酚酸B对大鼠血清TAC、SOD活性及MDA水平的影响(x±s, n=10) Table 2 Effect of Sal B on levels of TAC, SOD, and MDA in serum of rats(x±s, n=10)

表 3(Table 3)

表 3 丹酚酸B对大鼠胰腺组织TAC、SOD活性及MDA水平的影响(x±s, n=10) Table 3 Effect of Sal B on levels of TAC, SOD, and MDA in pancreatic tissue of rats (x±s, n=10) 组别 剂量/ (mg·kg−1) T-AOC/ (μmol∙mg−1) SOD/ (U∙mg−1) MDA/ (nmol∙mg−1) 对照 — 73.37±14.10 11.66±2.50 2.81±0.83 模型 — 28.14±6.25** 3.88±0.57** 5.58±0.74** Sal B 160 55.17±12.27## 7.48±2.99# 3.22±0.57## Sal B 80 53.53±11.33## 6.37±1.77# 4.31±0.82#

表 3 丹酚酸B对大鼠胰腺组织TAC、SOD活性及MDA水平的影响(x±s, n=10) Table 3 Effect of Sal B on levels of TAC, SOD, and MDA in pancreatic tissue of rats (x±s, n=10)

与对照组比较，模型组大鼠胰腺组织PDX-1蛋白水平显著降低（P＜0.01），给予丹酚酸B可明显提高大鼠胰腺PDX-1蛋白水平（P＜0.05、0.01），这一结果与丹酚酸B减少胰岛细胞凋亡、改善胰岛功能作用一致，提示丹酚酸B可能通过上调PDX-1蛋白表达而发挥胰岛细胞保护作用，见图 5。

图 5 丹酚酸B对大鼠胰岛组织PDX-1蛋白水平的影响(x±s, n=4) Fig.5 Effect of Sal B on levels of PDX-1 protein in pancreatic tissues of rats (x±s, n=4)

高血糖是糖尿病最主要的临床特征，长期高血糖既是糖尿病各种并发症的元凶，更是糖尿病患者胰岛功能进行性减退的主要诱因之一。因此，降血糖历来是糖尿病治疗的最主要措施。然而，近年来研究发现，糖尿病并发症及预后除与血糖水平有关，还与血糖波动性密切相关，血糖波动幅度越大，糖尿病并发症越严重，预后越差。因此，Monnier等^[8]提出了“血糖四分体”的概念，即糖尿病血糖控制要关注GHb、FBG、餐后血糖和血糖波动四位一体，这对糖尿病血糖控制提出了更严格的要求。然而，由于受饮食及治疗依从性等多方面因素的影响，糖尿病患者常难以有效控制血糖波动。因此，积极防治血糖波动所致的胰岛功能损伤就成为防治糖尿病并发症、改善预后的重要措施之一。本研究采用高糖高脂饮食合并ip STZ的方法建立大鼠糖尿病模型，并通过错时给予胰岛素或葡萄糖建立更符合临床特征的糖尿病血糖波动模型。研究结果显示，糖尿病大鼠血糖波动6周后，大鼠胰岛细胞凋亡率明显增加，胰岛数量减少，体积缩小，INS分泌能力明显下降，同时大鼠FBG、GHb水平明显升高，提示大鼠胰岛功能出现明显损伤，其机制可能与胰岛细胞凋亡增加有关，这一结果与文献报道相一致^[9]。给予丹酚酸B治疗6周后，糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡率显著下降，胰岛数量增加，体积增大，同时胰岛素分泌功能明显改善，FBG及GHb水平明显降低，提示丹酚酸B可明显减轻糖尿病血糖波动所致的大鼠胰岛损伤，改善胰岛功能，其机制可能与丹酚酸B抑制胰岛细胞凋亡有关。

氧化应激是机体或细胞内自由基的产生与清除失衡，导致活性氧和活性氮在体内或细胞内蓄积而引起氧化损伤。大量研究表明，高血糖尤其是波动性高血糖可损伤机体抗氧化系统，增加活性氧产生，诱导氧化应激状态^[10]。由于胰岛β细胞内抗氧化物酶活性较低，故β细胞更易受到氧化损伤，并在活性氧诱导下发生凋亡，导致胰岛素分泌功能进一步障碍，这可能是糖尿病患者胰岛功能进行性减退的主要原因之一。本研究显示，糖尿病大鼠血糖波动持续6周后，大鼠血清及胰腺组织SOD活性和TAC均显著降低，而脂质过氧化产物MDA水平明显升高，这一结果与文献报道基本一致^[11]，提示糖尿病血糖波动诱导了氧化应激状态，产生了明显氧化损伤。给予丹酚酸B 6周后，大鼠血清及胰腺组织TAC明显升高，MDA水平显著下降，这一结果与丹酚酸B抑制胰岛细胞凋亡、改善胰岛功能作用一致，提示丹酚酸B对糖尿病血糖波动模型大鼠胰岛保护作用与其提高抗氧化能力、抑制胰岛细胞凋亡有关。

PDX-1是胰岛β细胞特异表达的转录因子，在胰腺发育分化、胰岛素基因表达和胰岛素释放中均发挥重要作用，是维持胰岛β细胞正常形态和胰岛素分泌的必要条件^[12]。此外，PDX-1还可促进胰岛β细胞增殖，抑制β细胞凋亡^[13]，在胰岛β细胞新陈代谢中发挥重要调节作用。既往研究表明，PDX-1表达减少是胰岛细胞凋亡增加的主要原因之一，而增加PDX-1表达则可通过上调抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xL表达抑制胰岛细胞凋亡^[14-15]。活性氧可明显抑制PDX-1表达，诱导胰岛β细胞凋亡，并可降低PDX-1与胰岛素基因启动子结合活性，从而导致胰岛素合成和释放减少^[16]，这也是高血糖尤其是波动性高糖诱导胰岛功能损伤的机制之一。本研究结果显示，给予丹酚酸B可明显上调糖尿病大鼠胰腺组织PDX-1蛋白表达水平，这一结果与丹酚酸B减少胰岛细胞凋亡、改善胰岛功能作用相一致，提示丹酚酸B对糖尿病血糖波动模型大鼠胰岛细胞的保护作用与上调PDX-1表达、抑制胰岛细胞凋亡有关。

综上所述，丹酚酸B可明显减轻糖尿病血糖波动模型大鼠胰岛病理改变，改善胰岛功能，其机制可能与改善氧化应激、上调PDX-1蛋白表达，进而抑制胰岛细胞凋亡有关。