恶性肿瘤已经成为人类生命健康最危险的杀手，特别是人类对占恶性肿瘤90%以上的实体瘤一直无能为力^[1]。喜树碱（camptothecin，CPT）是从中国珙桐科（Nyssaceae）植物喜树Camptotheca acuminata Decne.茎提取物中分离得到的抗癌活性物质^[2]，它是目前为止发现的唯一1种拓扑异构酶（topoisomerase I）的抑制剂^[3-4]。临床研究证实喜树碱对胃癌^[5-6]、直肠癌^[7-8]、结肠癌^[9]和白血病^[10-11]等多种恶性肿瘤均有一定的疗效。我国是喜树碱的唯一原产国，目前喜树碱已成为继紫杉醇（paclitaxel）之后第2个由植物衍生的重要抗癌药物^[12]。

喜树碱的分子式为C₂₀H₁₆N₂O₄，相对分子质量为348.34。喜树碱不溶于水，这就造成了它口服后生物利用度低的缺点，严重限制了其在临床中的使用^[13-15]。虽然科学家后来通过成盐的方法水解其分子中的酯环，增加了水溶性，开发出了副作用更小的羟基喜树碱（hydroxycamptothecine）等其他喜树碱衍生物的注射液或粉针剂，但却伴随着其抗肿瘤活性的下降^[16]。微粉化（micronization）颗粒是解决喜树碱水溶性差的方法之一，药物微粉化后，粒径变小、形态均一、比表面积增大，可以增大其在溶剂中的溶解度^[17-18]，进而增大其口服生物利用度。本研究利用乳化法，制备了喜树碱微粉，并对制备工艺进行了优化。在最优条件下制得的喜树碱微粉进行了形貌表征、溶出测试和生物利用度评价。

MM400型光学显微镜，日本Nikon公司；S4800型扫描电镜（SEM），日本Hitachi公司；Zeta PALS型激光粒度仪，美国布鲁克海文；3k-15型高速离心机，德国Sigma公司；BS110型电子分析天平，德国Sartorius公司；XW-80A旋涡混合器，上海医科大学仪器厂；KQ-250DE型超声机，昆山市超声仪器有限公司；WG500CY型连续式实验室乳化机，上海路诺流体设备制造有限公司；AH-100D型高压均质机，上海ATS工业系统有限公司；2795型高效液相色谱仪，美国Waters公司；液相色谱柱Diamonsil反向柱C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），迪马科技有限公司；7890A-5975C型高效气相色谱仪，DB-WAX聚乙二醇毛细管柱（30.0 m×250 μm，0.25 μm），G1540N-210 FID检测器，美国Agilent公司；Scientz-18N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

喜树碱，质量分数98.5%，四川广瀚生物技术有限公司；聚山梨酯-80（Tween-80，T80）、乙醚，天津市博迪化工有限公司；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP-K30）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、羟丙基甲基纤维素（HPMC）、泊洛沙姆188（Poloxamer 188，P188），天津光复精细化工研究所；甲醇、乙腈（色谱纯）、三氯甲烷（分析纯），山东禹王实业有限公司；甘露醇，天津市科密欧化学试剂有限公司；SD大鼠10只，体质量220～250 g，雌性，哈尔滨医科大学；肝素钠，湖北鑫润德化工有限公司；模拟胃液、去离子水，实验室自制。

首先将T80、PVP-K30、CMC-Na、HPMC、P188共5种表面活性剂溶解在水相中，体积分数均为0.2%，药物质量浓度为3 mg/mL，水相与油相体积比（7：3），油相为三氯甲烷-甲醇（8：2），匀浆速率为5 000 r/min，匀浆时间为7 min。在前期预试验中发现，三氯甲烷与甲醇体积比为8：2时对喜树碱具有较好的溶解度，因此选择这个比例。待形成初乳后，检测其粒径。采用激光粒度分析仪进行粒径检测：室温下，样品反应完后用移液枪吸取3 mL放入样品池进行检测。每个试验重复测定3次。结果如表 1所示，T80和HPMC的加入对喜树碱乳剂粒径的影响较为明显。在制备过程中，加入适宜的表面活性剂可对乳滴表面进行改性，在控制乳滴生长和团聚的同时，也可以影响乳滴形貌。加入同样比例的T80和HPMC时粒径最小，然而由于加入T80时多分散系数更小，为0.005 0±0.000 1，得到的粒径更加均匀，故本研究选择以T80作为乳化剂。

表 1(Table 1)

表 1 不同表面活性剂对喜树碱初乳粒径的影响 Table 1 Effects of different kinds of surfactants on particle size of CPT foremilk 表面活性剂 平均粒径/nm 多分散系数 T80 53.5±1.7 0.005 0±0.000 1 CMC-Na 580.4±10.3 0.005 0±0.000 5 HPMC 20.6±3.8 0.231 0±0.024 0 PVP-K30 629.5±12.2 0.005 0±0.000 4 P188 444.8±11.9 0.005 0±0.000 2

表 1 不同表面活性剂对喜树碱初乳粒径的影响 Table 1 Effects of different kinds of surfactants on particle size of CPT foremilk

喜树碱质量浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL时，平均粒径分别为（64.4±5.1）、（135.5±19.3）、（156.1±31.8）、（160.2±21.3）、（213.4±27.6）nm。喜树碱的质量浓度变化对喜树碱乳剂粒径的影响较为明显，喜树碱乳剂粒径大小随着喜树碱的质量浓度增加而增大。喜树碱质量浓度的增加，油相黏度就会增加，乳滴间容易发生团聚，从而导致喜树碱乳剂粒径增大。考虑到工艺效率和成本，更低的喜树碱质量浓度水平没有进行进一步考察。因此以平均粒径作为优选指标，喜树碱的质量浓度选定为1 mg/mL。

水相与油相体积比分别为9：1、8：2、7：3、6：4、5：5时，平均粒径分别为（153.4±20.1）、（116.2±5.4）、（42.3±4.6）、（66.7±15.2）、（113.5±15.4）nm。水与三氯甲烷-甲醇的体积比对喜树碱乳剂粒径的影响也较为显著。喜树碱初乳的粒径大小随着水与三氯甲烷-甲醇的体积比的增加而减小，而后随着体积比的进一步增大粒径又随之增大。综合考虑乳剂粒径大小和乳化状态，选取水相与油相体积比7：3作为最优条件。

表面活性剂的用量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%时，平均粒径分别为（176.3±22.1）、（138.4±7.5）、（99.7±12.8）、（46.7±5.4）、（135.0±14.1）nm。T80与水的比例对喜树碱乳剂粒径大小有较显著影响，也呈现出随着T80体积分数增加粒径先降低，当T80体积分数为0.4%时，粒径最小为（46.7±5.4）nm，之后再呈增加的趋势。因此，本实验优选T80体积分数为0.4%。

匀浆速率对喜树碱乳剂粒径大小也有一定程度的影响。匀浆速率分别为3 000、4000、5 000、6 000、7 000 r/min时，平均粒径分别为（211.4±45.3）、（53.9±2.1）、（55.4±8.4）、（54.2±4.6）、（43.7±5.1）nm。匀浆速率由3 000 r/min提高到4 000 r/min时，平均粒径大幅度减小。匀浆速率处于4 000～7 000 r/min时，乳剂的粒径基本不随匀浆速率变化而变化。综合乳剂粒径和能耗的考虑，4 000 r/min被选择为最佳匀浆速率条件。

匀浆时间分别为3、5、7、9、11 min时，平均粒径分别为（60.3±5.1）、（47.5±2.3）、（42.3±4.5）、（37.1±3.6）、（30.4±3.6）nm。随着匀浆时间增加，平均粒径随之逐渐减小。喜树碱乳剂的平均粒径随匀浆时间增加逐渐减小，可能是由于匀浆时间短导致乳化不充分，有些乳滴有团聚现象，因而粒径较大。随着匀浆时间增加，体系得到充分混合乳化，粒径逐渐减小。然而，机械搅拌产生的机械能会传递给乳剂使得乳滴能量增大，为了减小自身的能量，乳滴之间可能会采取相互团聚的方式来减小比表面积进而降低能量，所以匀浆时间也不能过长。因此选择11 min作为最佳条件匀浆时间。

通过单因素法得出初步乳化的最优条件：喜树碱的质量浓度为1 mg/mL、水相与油相体积比为7：3、匀浆速度为7 000 r/min、匀浆时间为11 min。在室温下，将在该条件下得到的样品用移液器吸取适量，滴在血球计数板上，采用光学显微镜进行形貌观察，可以清晰地看到均匀的液滴，见图 1。液滴边缘与内部具有一定的色差，这是由水相与有机相透光率的差异导致的。最优条件下得到的喜树碱初乳的粒径大小为（30.3±1.8）nm，如图 2所示。

图 1 光学显微镜下的喜树碱初乳状态(10 × 20) Fig.1 Status of CPT foremilk under optical microscope (10 × 20)

图 2 喜树碱初乳的粒径分布 Fig.2 Particle size distribution of CPT foremilk

在喜树碱初乳制备最优条件后，在该条件下，对高压均质制备纳米乳工艺中高压均质压力和次数进行单因素优化。高压均质压力和均质次数分别为20、30、40、50、60 MPa及3、5、7、9、11次。先优化均质压力，均质次数固定为7次。

高压均质压力分别为20、30、40、50、60 MPa时，平均粒径分别为（15.3±1.8）、（15.5±2.1）、（15.7±3.2）、（15.9±3.6）、（18.7±3.4）nm。结果表明，在均质次数一定的情况下，随着压力的增大，粒径小幅度变大，但总体来讲粒径趋于稳定，这是因为经过高速匀浆后得到的喜树碱初乳，粒径已经很小，只是整体稍不均匀，使用高压均质机可以使初乳形成更加均一稳定的纳米粒。因此，只要较小的均质压力便可使喜树碱初乳形成均一稳定的纳米乳剂。

均质次数分别为3、5、7、9、11次时，平均粒径分别为（23.3±1.6）、（20.6±2.1）、（18.6±1.4）、（19.3±2.3）、（20.7±4.5）nm。结果表明，在一定均质压力下，随着均质次数的增加，粒径首先呈下降的趋势。由于均质次数增加，机械作用时间变长，大的乳滴被均质后变小。但当均质次数持续增加，粒径反而随次数的增加而增大。以粒径作为考虑选择高压均质压力20 MPa，均质7次，作为最优条件。

高压均质会使得纳米粒粒径减小、均匀，但高压均质的压力及次数，如果持续增大到某一个值后，纳米粒的粒径反而增大，可能是由于均质压力过高，或均质次数过多，乳状液中的乳滴重新聚集而使粒径增大，有限的乳化剂不能被有效地吸附到所有粒径表面，乳化作用下降，粒子液滴相互聚集，会出现粒径增大以及不稳定现象。

乳化均质后，用光学显微镜直接观察微乳的状态，如图 3所示，喜树碱纳米乳呈现近似球形的形貌，且颗粒大小比较均匀。最优条件下得到的喜树碱乳剂粒径大小为（18.7±1.3）nm，如图 4所示。

图 3 光学显微镜下的喜树碱纳米乳状态(10 × 20) Fig.3 Status of CPT nanoemulsion under optical microscope (10 × 20)

图 4 喜树碱纳米乳的粒径分布 Fig.4 Particle size distribution of CPT nanoemulsion

获得最佳工艺条件制备的喜树碱纳米乳后，旋转蒸发法去除其中的有机溶剂即得到喜树碱纳米混悬剂，然后分别加入喜树碱用量5倍的甘露醇，混匀，在−40 ℃的低温冰箱中预冻2 h、真空冷冻干燥机中冷冻时间为48 h，即得喜树碱微粉。原粉用双面导电胶粘在观察台上喷金；喜树碱微粉用水复溶后滴在锡箔纸上，置于超净工作台内吹干，在氩气保护下进行喷金即可进行形貌观察。

图 5-A显示喜树碱原粉呈不规则片状，粒径在1～60 μm。甘露醇呈长条状，长度达几十微米（图 5-B）。喜树碱微粉（图 5-C）呈现细小颗粒状，被甘露醇包裹，颗粒大小比较均匀。由于喜树碱在碱性条件下容易开环，相对的酸性条件下会更加稳定，所以喜树碱微粉口服制剂经过胃肠道低pH值环境要比其衍生物的注射针剂稳定性更好一些。

图 5 喜树碱原粉(A)、甘露醇(B)和喜树碱微粉(C)的SEM检测 Fig.5 SEM images of raw CPT (A), mannitol (B), and CPT micronized powder (C)

如图 6所示，喜树碱原粉（左）和微粉（右）在水中的分散情况，二者喜树碱用量一致，可以看出微粉复溶后状态良好，半透明且泛有乳光。用水复溶后，药物平均粒径大小测试为（165.5±5.3）nm，且分布很均匀，如图 7所示。

图 6 喜树碱原粉(左)和喜树碱微粉(右)在水中的分散性 Fig.6 Dispersion appearances of raw CPT (left) and CPT micronized powder (right) in water

图 7 喜树碱微粉粒径分布图 Fig.7 Particle size distribution of CPT micronized powder

搅拌速度和溶液温度分别控制在100 r/min和（37.0±0.5）℃，溶出介质选用模拟胃液。测平衡溶解度时加入过量样品，搅拌48 h后取上清过0.22 μm滤膜进HPLC检测。测溶出时将含有39 mg喜树碱的2组样品分别添加到500 mL溶出介质当中，在5、10、15、30、45、60、120、240 min时间点上取样品溶液5 mL，再补充相同体积溶出介质。取出的样品溶液用0.22 μm滤膜滤过除去杂质颗粒，得到滤液进HPLC检测药物浓度。检测条件如下：流动相组分为乙腈-水（40：60），体积流量1.0 mL/min，检测波长254 nm，进样量10 μL，柱温为室温。

HPLC结果显示喜树碱原药的饱和溶解度为92.46 μg/mL，喜树碱微粉的为218.28 μg/mL。图 8显示了喜树碱原药和微粉的溶出特性，与喜树碱原药对比，喜树碱微粉显示出了更快的溶出速率。喜树碱原粉由于水溶性差，未能完全溶解，45 min时仅溶出8.09%，而此时，喜树碱微粉已溶出72.48%。240 min时微粉溶出93.22%，而原粉仅为18.33%。喜树碱微粉的溶出速率较原药提高了4.09倍。

图 8 喜树碱原药和微粉在模拟胃液中的溶出曲线 Fig.8 Dissolution profiles of raw CPT and CPT micronized powder in simulated gastric fluid

将10只大鼠随机分为2组，将大鼠在相同的温度、湿度、饮食条件下，饲养1周。实验前12 h禁食，自由饮水。根据大鼠的体质量，分别ig给予喜树碱原料药（对照组）和喜树碱微粉（实验组），给药剂量均为50 mg/kg（微粉按喜树碱实际质量计算）。采取眼底静脉取血，间隔时间为给药后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h取血1 mL，置于肝素抗凝的离心管中。将取出的大鼠血样，放入离心管中（含肝素钠），3 000 r/min，离心10 min。取上清100 μL于1.5 mL离心管中，加甲醇300 μL，涡旋振荡混匀3 min，超声10 min，10 000 r/min离心10 min，取上清10 μL进HPLC检测。

喜树碱原料药和喜树碱微粉ig给药后平均血药浓度-时间曲线见图 9。口服喜树碱原料药后，药物在大鼠体内的吸收时间较缓慢，4 h后达到最大血药浓度是（1.549±0.155）ng/mL；口服喜树碱微粉后，0.5 h血药浓度达到（0.613±0.067）ng/mL，最大血药浓度增大到（2.737±0.233）ng/mL。根据相对生物利用度公式计算出，喜树碱微粉的相对生物利用度为喜树碱原药的3.10倍，微粉化后的喜树碱在大鼠体内的生物利用度大大提高。本实验采用DAS 2.0软件对数据进行模型拟合，拟合后得到喜树碱原药和喜树碱微粉的动力学参数值（表 2），喜树碱原药为权重系数为1的一室模型，喜树碱微粉为权重系数为1的二室模型，因为二者房室模型不同，所以部分对应的考察参数会有不同。

图 9 喜树碱原药和喜树碱微粉的血药浓度-时间曲线(x±s, n=5) Fig.9 Blood concentration of raw CPT and CPT micronized powder (x±s, n=5)

表 2(Table 2)

表 2 喜树碱原药和喜树碱微粉房室模型药物动力学参数 Table 2 Pharmacokinetic parameters of compartment model for raw CPT and CPT micronized powder 房室参数 单位 喜树碱原药 喜树碱微粉 t1/2 h 3.047 — t1/2α h — 1.760 t1/2β h — 2.439 V1/F L·kg-1 25 624.390 1 020.402 CL/F L·h-1·kg-1 5 829.626 1 891.132 AUC0~t μg·L-1·h-1 8.433 26.108 AUC0~∞ μg·L-1·h-1 8.577 26.439 Ke h-1 0.228 — K10 h-1 — 1.853 K12 h-1 — 1.514 K21 h-1 — 0.339 Ka h-1 3.860 0.715 MRT0~t h 7.782 7.513 MRT0~∞ h 9.890 9.481 tmax h 4.000 4.000 Cmax μg·L-1 1.549 2.737

表 2 喜树碱原药和喜树碱微粉房室模型药物动力学参数 Table 2 Pharmacokinetic parameters of compartment model for raw CPT and CPT micronized powder

称取100 mg喜树碱微粉，加入500 μL乙醇，超声萃取40 min，得喜树碱微粉乙醇溶液。而后配制甲醇和三氯甲烷标准乙醇溶液，其中甲醇质量分数为2 mg/g，三氯甲烷质量分数为0.06 mg/g。对以上2种样品10 000 r/min下离心5 min进样，进行GC检测。检测条件：柱温箱温度刚开始在80 ℃保持2 min，然后以15 ℃/min的速率升到270 ℃，并保持10 min。进样器和检测器温度都设为280 ℃。纯度为99.99%的氮气作为载气，体积流量为20 mL/min。氢气和空气体积流量为30、400 mL/min。样品每次进样量为2 μL，分流比为25：1。检测结果如图 10所示，图中A和B的尖峰代表乙醇，甲醇（峰1）和三氯甲烷（峰2）的保留时间分别为1.855 min和3.68 min，而对应的喜树碱微粉乙醇萃取溶液由于其中二者的量过低，在图 10-B中没有出现明显的峰，峰面积可由气相色谱仪检测报告获取。由外标一点法计算可得喜树碱微粉中甲醇和三氯甲烷残留量分别为0.064和0.014 mg/g。

图 10 甲醇-三氯甲烷对照品溶液(A)及喜树碱微粉乙醇萃取溶液(B)的GC图 Fig.10 GC of methanol-chloroform reference substance solution (A) and ethanol extract liquor from CPT micronized powder (B)

微粉化的喜树碱跟其原料粉相比，具有更小的粒径和更大的比表面积，因此它的溶出速率增快、溶解度增加。同时，它的口服生物利用度也得到了提高。

本次研究中使用到了国际药品注册协调会议（International Conference on Harmonization，ICH）II类低毒溶剂甲醇和三氯甲烷。因此采用GC来检测喜树碱微粉的溶剂残留。最终测得的喜树碱微粉中甲醇和三甲烷残留量分别为0.064 mg/g和0.014 mg/g，符合ICH规定的甲醇和三氯甲烷3 mg/g和0.06 mg/g的限度。