鸦胆子油（Bruceae Fructus oil，BFO）是从苦木科鸦胆子属植物鸦胆子Brucea javanica (L.) Merr.成熟果实中提取而得的油脂类物质。现代药理学研究表明BFO具有抗癌、抗病原体、抗氧化、抗胃溃疡等作用。临床上将其制成10% BFO乳剂，作为辅助抗肿瘤药物^[1-4]，用于治疗消化系统肿瘤。乳剂属于多相动力学不稳定分散体系，在受热、受冷及长期储存过程中均能引起乳析和破裂，渗漏的BFO毒性很大，对胃肠黏膜和血管壁的刺激性也很严重。

环糊精（cyclodextrin，CD）是由α-1, 4葡萄糖苷键连接的环状低聚糖，其独特的笼状结构可以包合药物分子形成包合物，此时药物分子被包含于CD分子空腔中，具有很高的分散度，同时由于CD外部多羟基的亲水性，使包合物具有良好的可润湿性，从而达到对难溶药物的增溶效果，能显著改善药物的理化性质^[5-9]。本实验中所用的交联环糊精（环糊精聚合物，CDP）是一种将CD和环氧氯丙烷（EP）交联得到的聚合物。实验证明该聚合物易溶于水^[10]，当小分子药物与该类聚合物复合后，能使药物的溶解度增加、稳定性提高、毒副作用降低、药代动力学改善^[11]。本实验研制了BFO-CDP包合物（BFO-CDP-IC），并对其进行表征，通过急性毒性试验测定其半数致死量（LD₅₀），并与市售BFO乳剂进行安全性比较。

1 仪器与材料

磁力搅拌器，上海沪西分析仪器厂；剪切乳化均质机，上海标本模型厂；Tensor27傅里叶变换红外光谱（FTIR）仪、AVANCE600核磁共振仪，德国Bruker公司；S-4800场发射扫描电子显微镜（SEM），日本Hitachi High-Technologies公司；Waters e2695高效液相色谱仪、Waters 2998 PDA检测器，美国Waters公司。

BFO，实验室自制；鸦胆子苦醇，中国食品药品检定研究院，批号140208，质量分数≥98%；BFO乳剂，广州白云山明兴制药有限公司，批号0114101412；β-环糊精（β-CD）、EP、NaOH和其他试剂均购自国药集团化学试剂公司。清洁级ICR小鼠120只，雌雄各半，体质量18～22 g。购自扬州大学比较医学中心，许可证号SCXK（苏）2010-0004。

2 方法与结果 2.1 BFO的提取

将鸦胆子仁用万能粉碎机粉碎后，用滤纸包好，置于索氏提取器中，以石油醚（沸程60～90℃）为提取溶剂，液料比6:1，水浴回流提取，直到提取液无色为止^[12]，BFO得率为17.3%。以《中国药典》2015年版记载方法对本实验中所提BFO的理化性质进行测定，其色草绿，澄明，油状，味苦，有油脂香。密度0.900 g/mL；折光率1.470；酸值8.142 6 mg KOH/g；皂化值197.0 mg KOH/g；过氧化值6.038 3 mmol/kg；碘值0.991 7 g碘/g。

2.2 CDP的合成及其表征 2.2.1 CDP的合成

将15.76 g NaOH加入32 mL H₂O中，搅拌至溶解后称取20 gβ-CD加入，搅拌至溶液澄清。将9.64 mL的EP加入溶液中，搅拌24 h，冷却至室温。用透析法除去盐后，将透析后的溶液用旋转蒸发仪蒸发至黏稠状，加入无水乙醇析出白色固体，滤过，真空干燥，即得到CDP^[13]，反应产率为49.26%。根据苯酚-硫酸法测定水解液中葡萄糖的量，算出聚合物的交联度为8.47。

2.2.2 CDP的表征

（1）SEM法：分别取少量β-CD、CDP均匀固定于样品台上，导电胶粘样、喷金镀膜后置于SEM中观察其表面形态特征。由于EP的交联作用致使两者晶格排列发生变化，产生形态学差异^[14]。如图 1所示，β-CD与CDP的电镜行为有明显不同。β-CD表面疏松，而CDP表面光滑，可能是在与EP聚合过程中形成了多个支化点，因此得到了具有较好机械强度、良好稳定性的产物^[15]。与聚合前相比，CDP的表面形态产生了显著变化，说明CDP的形成。

（2）FTIR法：分别取β-CD、CDP适量，与KBr充分混合研磨，置于压片机中压片。扫描波数范围设定为4 000～400 cm⁻¹，于相同条件下对两者进行测定。比较两者-OH、-CH₂、C-O-C键吸收峰强度变化，判断是否成功合成CDP。

CD聚合反应过程为CD外部O-H键断裂，与EP键合，此过程中-OH减少，同时引入碳链和仲-OH，因此可以通过观察FTIR和¹H-NMR图谱中羟基和质子峰的强弱或化学位移（δ）来判断是否合成CDP^[16]。

如图 2所示，与β-CD相比，CDP的红外吸收光谱在3 400～3 300 cm⁻¹处的吸收减弱，而1 100～1 000 cm⁻¹左右-OH伸缩振动吸收变弱，这说明-OH的伸缩振动和平面弯曲也有所降低，这和EP与β-CD上-OH交联反应使-OH减少有关；在2 920 cm⁻¹左右的吸收峰是-CH和-CH₂的伸缩振动，CDP在此处的吸收峰增强，且在1 450 cm⁻¹附近出现了-CH的弯曲振动，这进一步说明EP和β-CD反应；CDP经过交联聚合后仍保留了β-CD的C-O-C和C-O键，因此，在CDP中-OH的减少，-CH₂和-CH链增长，极性较β-CD降低且保留了β-CD的原有空腔结构。

（3）¹H-NMR法：分别取适量β-CD、CDP，以重水（D₂O）为溶剂分别溶解，测定它们的¹H-NMR谱图。¹H-NMR法是一种运用较为广泛的分析检测和验证的方法，如图 3所示，图中δ 3.55～4.00的吸收峰为β-CD氢的化学位移，δ 4.02、3.97（双峰）为β-CD与EP发生交联反应后出现的新峰，说明发生了交联反应从而出现了新的羟基峰；δ 5.15（单峰）为碳链上-OH的峰，因此证明已成功合成CDP。EP与CD反应之后，会在δ 3.0～4.0出现新峰，和CD原有的峰重叠，所以出现谱图上的峰形。

2.3 BFO-CDP-IC的制备及其表征 2.3.1 BFO-CDP-IC的制备

精密称取10 g CDP置于烧杯中，加蒸馏水溶解，以300 r/min速度边均质边缓慢滴加1.7 mL BFO乙醚溶液，室温条件下均质6 min使成糊状，真空干燥，即得。

2.3.2 单因素考察

（1）主客体分子BFO与CDP投料比的影响：主客体分子的投料比是影响包封率的关键因素，本实验分别采用质量为2、4、6、8、10、12 g的CDP对BFO进行包合，其他工艺参数设置为包合温度20℃，均质时间6 min，稀释BFO的乙醚用量为0.5 g。结果表明，当CDP用量为10 g时，包封率最高。因此在正交设计中，将CDP的投料量设定为8、10、12 g。

（2）包合温度的影响：保持其他条件不变，分别在20、30、40、50、60℃条件下对BFO进行包合，结果表明在20～40℃，随着温度的升高，包封率增加明显，当温度高于40℃以后，包封率升高不明显。考虑到BFO受热不稳定，温度升高易导致其挥发，影响BFO的包封率。综合考虑将正交温度定为20、30、40℃。

（3）均质时间的影响：保持其他条件不变，将均质时间分别设为3、6、9、12、15 min，考察均质时间对BFO包封率的影响。结果表明，当均质时间为6 min时，所得包封率最高。6 min后随着均质时间延长包封率下降，可能是因为CDP分子空穴大，均质时间延长易导致BFO从空腔析出，因此正交试验中将均质时间设定为3、6、9 min。

（4）稀释BFO的乙醚用量的影响：保持其他条件不变，改变稀释BFO的乙醚用量，将溶液中稀释BFO的乙醚用量分别设为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g，考察其对BFO包封率的影响。随着稀释BFO的乙醚用量的增加包封率逐渐升高，但稀释BFO的乙醚用量过高时，也会导致包封率降低，故将正交试验中稀释BFO的乙醚用量设定为0.3、0.4、0.5 g。

2.3.3 HPLC定量测定方法的建立

（1）色谱条件：色谱柱为Symmetry C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-水（5:5），体积流量为0.8 mL/min，柱温为（25±5）℃，进样量40μL，检测波长为220 nm。对照品、BFO-CDP-IC供试品及空白样品的色谱图见图 4。

（2）对照品溶液的配制：精密称取鸦胆子苦醇对照品4 mg，溶于10 mL甲醇，配制成0.4 mg/mL鸦胆子苦醇的对照品储备液。

（3）BFO供试品溶液的配制：精密称取5 g BFO于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得0.5 g/mL的BFO供试品溶液。

（4）BFO-CDP-IC供试品溶液的配制：精密称取BFO-CDP-IC 1.0 g于10 mL量瓶中，加乙醚至刻度，置于超声波清洗机中超声1 h后，离心5 min，取上层，回收乙醚，加入甲醇定容至1 mL，得解包合BFO-CDP-IC供试液。

（5）空白样品溶液的制备：按照BFO-CDP-IC处方比例，不加鸦胆子油，按“2.3.1”项下方法制备阴性供试品，按“2.3.3（4）”项方法制得空白样品溶液。

（6）线性关系考察：精密吸取适量对照品储备液，用甲醇稀释至质量浓度分别为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL，分别进样40μL，记录色谱图及峰面积。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得鸦胆子苦醇标准曲线方程：Y=1×10⁷ X+987 534，r=0.999 8，表明鸦胆子苦醇在0.025～0.4 mg/mL线性关系良好。

（7）精密度试验：分别精密移取“2.3.3（2）”项下的鸦胆子苦醇对照品储备液0.1、0.2、0.4 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得质量浓度分别为4.0、8.0、16.0μg/mL的鸦胆子苦醇对照品溶液，按“2.3.3（1）”项下色谱条件注入液相色谱仪，每个质量浓度分别重复进样6次，以考察精密度。结果表明不同质量浓度下鸦胆子苦醇峰面积的RSD值分别为1.37%、1.44%、1.04%，表明该方法精密度良好。

（8）重复性试验：分别按“2.3.3（3）”和“2.3.3（4）”项方法制备BFO供试品溶液（0.1 g/mL）和BFO-CDP-IC供试品溶液，各6份，按“2.3.3（1）”项下色谱条件注入液相色谱仪，考察该方法的重复性。结果表明2种样品中鸦胆子苦醇的RSD值分别为1.06%、0.98%，表明该方法重复性良好。

（9）稳定性试验：分别按“2.3.3（3）”和“2.3.3（4）”项方法制备BFO供试品溶液（0.1 g/mL）和BFO-CDP-IC供试品溶液，在室温下放置0、2、6、8、12、24 h后，按“2.3.3（1）”项下色谱条件注入液相色谱仪，考察各供试品溶液稳定性。结果表明，2种供试品溶液不同时间下测定的鸦胆子苦醇峰面积RSD分别为0.40%、0.47%，表明24 h内2种供试品溶液稳定性良好。

（10）加样回收率试验：精密吸取按“2.3.3（4）”项下方法配制的已测定鸦胆子苦醇量的BFO-CDP-IC供试品溶液9份，每份各1 mL，分别精密加入一定量的鸦胆子苦醇对照品溶液（相当于鸦胆子苦醇0.025、0.050、0.100 mg），混匀，分为低、中、高3组，每组3份，按“2.3.3（1）”项下条件注入液相色谱仪，重复测定3次，取峰面积平均值，计算质量浓度、回收率和RSD值。测得鸦胆子苦醇加样回收率平均值为99.67%，RSD为1.64%，3个质量浓度的回收率符合定量测定要求，表明该方法加样回收率良好。

（11）包封率的测定：精密称取5 g BFO于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得0.5 g/mL的BFO供试品溶液。精密称取BFO-CDP-IC 1.0 g于10 mL量瓶中，置于超声波清洗机中超声1 h后，2 000 r/min离心5 min，浓缩至1 mL，得解包合后的BFO-CDP-IC供试液。分别进样40μL，记录色谱图及峰面积。按照下式计算BFO-CDP-IC的包封率及载药量。经HPLC法测得BFO中指标成分鸦胆子苦醇的量推算得BFO-CDP-IC中BFO的包封率为80%，载药量为7.1%。

包封率=W_包/W_投=(W_投-W_游)/W_投

载药量=(W_投-W_游)/W_总

W_投为总投药量，W_包为包入的BFO量，W_游为游离的BFO量，W_总为BFO-CDP包合物质量

2.3.4 BFO-CDP-IC制备工艺优化

根据单因素考察试验及相关文献报道^[17-19]，选取主客体分子BFO与CDP投料比（A）、包合温度（B）、均质时间（C）及稀释BFO的乙醚用量（D）4个因素进行考察，以包封率为评价指标，采用L₉(3⁴)正交试验设计筛选BFO-CDP-IC最佳工艺参数。因素水平、试验设计及结果见表 1，方差分析见表 2。

对考察指标进行直观分析及方差分析，结果显示4个影响因素中对BFO-CDP-IC包封率的影响大小顺序为C＞A＞B＞D，优组合为A₂B₁C₂D₃，优选出的最佳包合工艺为BFO与CDP投料比1:10，包合温度20℃，均质时间6 min，稀释BFO的乙醚用量0.5 g。

2.3.5 BFO-CDP-IC的表征

（1）SEM法：对CDP和BFO-CDP-IC样品经导电胶粘样、喷金镀膜后置于场发射扫描电镜中观察其表面形态特征。图 5-a、b分别为CDP、BFO-CDP-IC的SEM图，它们显示了2种不同物质的表面形态学特征^[20]。从图 5-a、b中可以明显看出CDP和BFO-CDP-IC的区别。CDP表面光滑，而BFO-CDP-IC表面有很多小孔，且能看到油滴状物质，说明BFO-CDP-IC的形成，BFO被包进CDP的空腔。

（2）FTIR法：分别取BFO、CDP、BFO与CDP两者的物理混合物以及BFO-CDP-IC适量，与KBr混合，压片，在扫描波数为4 000～400 cm⁻¹测定其FTIR图。图 6为BFO、CDP、BFO与CDP物理混合物以及BFO-CDP-IC的FTIR谱图。通过FTIR法可以有效地验证客体分子与CD是否产生包合作用，在包合物中可以观察到与包合之前客体分子的不同之处^[21]。BFO主要成分为油酸，在BFO中其量高达63.3%，在图 6-a其FTIR谱图里可以观察到油酸的特征吸收峰，在图 6-a中可以看到3 007 cm⁻¹处的吸收峰为油酸上的烯烃C-H伸缩振动，1 700 cm⁻¹左右的吸收峰为油酸的C=O峰。图 6-b中在3 400～3 300 cm⁻¹处的吸收峰为O-H的伸缩振动，在2 920 cm⁻¹左右的吸收峰是-CH和-CH₂的伸缩振动。以上特征吸收峰在BFO与CDP的物理混合物的FTIR谱图中均能找到。但是在图 6-d中，CDP的特征吸收峰均能找到，而油酸上的吸收峰有的发生变化，有的甚至消失，例如在3 007 cm⁻¹处的C-H伸缩振动，在包合物的红外谱图中就完全消失^[22]。

油酸原有的特征吸收峰应该在1 700 cm⁻¹左右，而包合物中C=O的吸收峰却在1 745 cm⁻¹。氢键的形成使电子云密度平均化，从而使伸缩振动频率降低，但包合物中C=O的吸收峰没有降低反而升高，说明BFO的C=O没有和CDP的-OH形成氢键，而是在环糊精的空腔内部。另外游离羧酸的C=O键频率出现在1 760 cm⁻¹左右，在固体或液体中C=O键频率出现在1 700 cm⁻¹，和FTIR谱图相符，由此可以判断进入到空腔内的BFO是游离分散的状态，也能进一步说明BFO在空腔内部，BFO的C=O吸收应该为二聚体的C=O吸收峰。

（3）¹H-NMR法：以D₂O为溶剂分别溶解CDP和BFO-CDP-IC，测定它们的¹H-NMR谱图。如图 7所示，CDP中质子受BFO的影响均发生明显的位移（表 3），并且在包合物的¹H-NMR谱图中BFO中油酸部分质子的化学位移和CDP重合，但是也有所显示，而其他大部分的峰都清楚的显示出来，部分峰发生位移^[23]。在BFO-CDP-IC的¹H-NMR谱图中出现了6组新的化学位移，其中高场区δ 0.88～2.26出现的5组新峰是油酸α-H以外其他的质子，而δ 5.31出现的新峰是油酸上的α-H。以上证据都能证明CDP中含有BFO。除此以外，还可以通过CDP的化学位移变化说明BFO已经包覆进入CDP的空腔内。包合物的¹H-NMR谱图中可以看出CDP的化学位移发生了明显的变化。

首先，BFO和CDP空腔内的H-3、H-5作用，使得其化学位移均发生了变化，向低场移动，说明客体分子进入了空腔内部，且客体分子插入较深，甚至位于空腔小口端的H-6也发生化学位移。同时其他峰也都有所不同，位于CDP分子空腔外部的H-1、H-2、H-4也发生化学位移，这进一步证明BFO已经进入到CDP内，形成了目标包合物。

2.4 急性毒性实验

小鼠120只，随机分为12组，每组10只，雌雄各半，BFO-CDP-IC和BFO乳剂各6组。在预试验及参考文献报道^[24]的基础上选1:0.8为剂量比，最高剂量为15.76 g/kg，最低剂量为6.29 g/kg，按等比稀释法配制不同质量浓度的BFO-CDP-IC和BFO乳剂，将其分别一次性ig给药后观察动物反应，连续观察14 d，并对死亡小鼠进行肉眼尸检，记录病变情况，试验结果用Bliss法计算半数致死量（LD₅₀）。

运用Bliss法计算BFO乳剂的LD₅₀值（表 4）。BFO乳剂的LD₅₀值为9.780 g/kg，BFO-CDP-IC观察期内供试组小鼠未见有死亡，仅在给药后出现蜷缩少动、呼吸急促等症状，但一段时间之后即恢复正常，说明在15.36 g/kg的剂量下是安全的。以上结果表明，BFO-CDP-IC的安全性明显高于市售BFO乳剂。

3 讨论

本实验成功制备CDP，并以CDP为药物载体，制备BFO-CDP-IC，通过SEM、FTIR、¹H-NMR对包合物进行表征，结果表明包合物制备成功。经HPLC法测得BFO中鸦胆子苦醇量为2 mg/g，测得BFO-CDP-IC的包封率为80%，载药量为7.1%。以包封率为考察指标通过正交试验优化制备工艺参数，确定最优工艺参数为CDP与BFO投料比为10:1（质量比），包合温度20℃，均质时间6 min，稀释BFO的乙醚用量为0.5 g。通过急性毒性实验将BFO-CDP-IC的安全性与市售BFO乳剂进行比较，通过实验测得市售BFO乳剂的LD₅₀为9.780 g/kg，而BFO-CDP-IC的LD₅₀未测出，由此可见BFO-CDP-IC的安全性显著高于市售BFO乳剂。