2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.15.023 |
2. 西南大学西藏农牧学院药用植物联合研发中心, 重庆 400715 ;
3. 中山大学生命科学学院, 广东 广州 510275 ;
4. 西南大学药学学院, 重庆 400715 ;
5. 西藏大学农牧学院, 西藏 林芝 850000
, QIN Bai-fu3, QIANG Wei1,2, QIU Fei1,2, HOU Yan-ling1,2, CHEN Min4, LAN Xiao-zhong5, LIAO Zhi-hua1,2
2. SWU-TAAHC Medicinal Plant Joint R&D Centre, Southwest university, Chongqing 400715, China ;
3. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China ;
4. School of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China ;
5. Agricultural and Husbandry College, Tibet University, Linzhi 850000, China
颠茄是我国药典收录的托品烷类生物碱（tropane alkaloids，TAs）药源植物[1]，其次生代谢产物莨菪碱（hyoscyamine）和东莨菪碱（scopolamine）具有重要的药用价值。TAs主要在须根中合成并存储于植物的根中，同时也存在转运机制将其运输到植物地上部位进行储存[2]。由于化学合成困难且昂贵，TAs无法进行大规模的人工合成[3]。目前，TAs主要从茄科类植物中提取[4]。因此，研究TAs代谢途径上的各种功能基因，进而采取分子生物学的方法提高颠茄中TAs的产量具有重要意义。
精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylase，ADC）是生物体中多胺合成途径上的一个关键限速酶，属于磷酸吡哆醛依赖性酶基因超家族Ⅲ型PLPDE成员，含有Ⅲ型PLPDE典型的N端Orn-Arg-deC-N结构域和C端Orn-DAP-Arg-deC结构域[5]。在磷酸吡哆醛的催化作用下，ADC可以催化精氨酸（arginine）脱羧[6]，生成鲱精胺（agmatine），再水解鲱精胺生成腐胺（putrescine），腐胺又可以在亚精胺合成酶（spermidine synthase）和精胺合成酶（spermine synthase）的作用下分别合成亚精胺（spermidine）和精胺（spermine）。
ADC的催化产物腐胺是托品烷类生物碱生物合成的前体物质，因此ADC基因对托品烷类生物碱的合成也具有重要作用。近年来，棉花[7]、甘蓝型油菜[8]、桃树[9]、甘蓝[10]、水稻[11]等多种植物的ADC基因已经被克隆，并证明其参与广泛的生理过程和胁迫反应，然而有关颠茄ADC（AbADC）基因的研究尚未见报道。本研究从颠茄中克隆到2条ADC基因，并进行了生物信息学分析、组织表达谱分析及盐胁迫和低温处理诱导表达分析，旨在为AbADC的进一步研究奠定基础，同时也为颠茄中托品烷类生物碱的合成代谢调控提供候选基因。
1 材料与试剂 1.1 材料样品由西南大学博士生导师廖志华教授鉴定为颠茄Atropa belladonna L.，植株保存于西南大学甘薯研究中心。大肠杆菌DH5α来源于复旦大学唐克轩教授实验室，现由本实验室保存。
1.2 试剂总RNA提取试剂盒为RNA simple Total RNA Kit（TIANGEN）；RNA反转录及3’RACE试剂盒为RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（TaKaRa）；5’RACE试剂盒为BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，BD AdvantageTM 2 PCRKit（CLONTECH）；质粒提取及胶回收试剂盒为BioSpin Gel Extraction Kit、BioSpin plasmid DNA Extraction Kit（BioFlux）；高保真Taq DNA聚合酶为PrimeSTAR HS DNA Polimerse（TaKaRa）；T载体、连接试剂盒、荧光定量相关试剂分别为pMD19-T Vector、DNA Ligation 2.0、PrimerScipt TM RT-PCR Kit和SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）（TaKaRa）。本研究所用引物及测序服务由上海英骏生物技术有限公司提供。其他试剂均为国产分析纯试剂。
2 方法 2.1 RNA的提取与cDNA的合成取适量颠茄样品在液氮中研磨，按照RNA simple Total RNA Kit说明书提取总RNA，HITACHI U-3010紫外可见分光光度计检测RNA纯度和浓度。严格按照RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（TaKaRa）试剂盒说明书反转录获得第一链互补链DNA（cDNA）用于核心片段PCR扩增和3’RACE，按照BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit和BD AdvantageTM 2 PCR Kit（CLONTECH）试剂盒说明书反转录获得第一链互补链DNA（cDNA）用于5’RACE。
2.2 AbADC1和AbADC2基因的克隆在NCBI网站上下载已报道的烟草、曼陀罗、大豆、马铃薯ADC基因的cDNA序列。使用软件Vector NTI8.0进行ADC核苷酸序列的多重比对，根据保守区段的核苷酸序列设计一对简并引物F-AbADC、R-AbADC（本研究所有引物序列均见表 1），以上述第一条cDNA链为模板进行AbADC核心片段的扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳和紫外检测后，回收合适大小的DNA条带。胶回收产物与PMD19-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于加有氨苄霉素的LB平板上，37 ℃培养约12 h后挑取抗性菌落，PCR检测为阳性后送测序。根据测序结果，分别设计3’RACE的基因特异性引物（F-AbADC1-3-1、F-AbADC1-3-2、F-AbADC2-3-1、F-AbADC2-3-2）和5’RACE的基因特异性引物（R-AbADC1-5-1、R-AbADC1-5-2、R-AbADC2-5-1、R-AbADC2-5-2），以相应的cDNA为模板进行巢式PCR扩增，同上方法回收并测序。将获得的AbADC1、AbADC2的核心片段，3’RACE序列和5’RACE序列在VectorNTI8.0软件中进行电子拼接，拼接后获得AbADC1、AbADC2的电子拼接cDNA全长序列。根据电子全长序列设计扩增AbADC1、AbADC2的物理全长的PCR引物（F-AbADC1、R-AbADC1、F-AbADC2、R-AbADC2），进行PCR扩增。回收合适大小的电泳条带，连接T载体后转化大肠杆菌，对PCR检查为阳性的克隆进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，判断其序列为AbADC1、AbADC2的物理全长序列。
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表 1 基因克隆和荧光定量PCR所用到的引物 Table 1 Primers designed for detection of gene cloning and real-time PCR |
2.3 AbADC基因的生物信息学分析
利用生物信息学软件和生物信息学网站进行AbADC1、AbADC2的生物信息学分析。核苷酸序列比对使用Vector NTI8.0 软件进行。开放阅读框（ORF）的查找和核苷酸的翻译在http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站的ORF Finder上进行。利用http://www.expasy.org网站提供的相关生物信息学分析软件（如TargetP）进行蛋白质基本性质及转运肽的预测。在PBIL网站进行二级结构预测。利用CLUXTALX进行氨基酸序列的多重比对。在CCD数据库和InterPro中分析蛋白保守结构域。利用WOLF POSRT网络服务器对AbADC1和AbADC2进行亚细胞定位分析。利用MEGA4.1中的邻位相联法（neighbor-joining，NJ）构建进化树，重复次数设为1 000次。
2.4 AbADC基因的组织表达谱分析提取颠茄的主根、须根、老叶、嫩叶、嫩茎、花蕾、花蕊、花萼、花瓣、青果和果萼11个部位的总RNA，使用RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（TaKaRa）试剂盒将各组织的RNA进行反转录，得到cDNA第一链作为实时定量PCR（qRT-PCR）模板。使用BIO-RAD IQTM5 Multicolor Real-Time PCR仪，参照SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）试剂盒说明书进行qRT-PCR反应。反应条件及程序均按照相关试剂盒说明书进行。以PGK基因作为内参，根据Pfaffl Method方法计算各基因的相对表达量。
2.5 AbADC基因的诱导谱分析取3根3～5 cm长的颠茄发根尖接种于150 mL MS液体培养基中，25 ℃、110 r/min，摇床黑暗培养30 d后，收取发根材料作为空白对照，其余培养瓶倒掉先前的MS培养基，重新加入150 mL MS培养基。NaCl诱导项：培养基中加入NaCl使其终浓度为100 mmol/L，继续置于25 ℃，转速为110 r/min的摇床上培养；4 ℃诱导项：将换培养基后的三角瓶放置在4 ℃培养；所有诱导项分别在诱导0、4、12、24 h后取材，应用qRT-PCR技术分别检测AbADC1和AbADC2的表达情况。
3 结果与分析 3.1 AbADC基因的克隆和序列分析以颠茄总RNA逆转录获得的cDNA为模板，利用兼并引物进行AbADC保守结构的PCR扩增，成功获得一段约1 226 bp和一段约1 232 bp的核心片段，分别命名为AbADC1和AbADC2。根据获得的AbADC核心片段信息，设计3’RACE和5’RACE巢式引物，用于AbADC基因3’端和5’端序列的克隆。经过2轮巢式扩增，由AbADC1核心片段获得长度分别为437 bp的3’端和630 bp的5’端片段，由AbADC2核心片段获得长度分别为837 bp的3’端和719 bp的5’端片段，将获得的核心、3’端和5’端序列在Vector NTI 8.0软件中进行重叠群分析，拼接得到2 817 bp的ADC1和2 992 bp的AbADC2基因cDNA电子全长序列。设计物理全长引物并利用高保真酶进行PCR扩增，得到AbADC1基因cDNA全长序列为2 817 bp，该物理全长包括长约2 136 bp的编码框，预测编码712个氨基酸；得到的AbADC2基因全长序列为2 992 bp，该物理全长包括2 145 bp的编码框，预测编码715个氨基酸。
3.2 AbADC基因编码蛋白的生物信息学分析 3.2.1 理化性质分析AbADC1蛋白由712个氨基酸编码，预测相对分子质量为77 600，理论等电点为4.94；AbADC2蛋白由715个氨基酸编码，预测相对分子质量为76 700，理论等电点为4.93。
3.2.2 AbADC编码蛋白二级结构预测PBIL网站预测AbADC1编码蛋白包含36.52%的α-螺旋、16.15%的延伸链和47.33%的无规卷曲；AbADC2编码蛋白包含35.38%的α-螺旋、17.34%的延伸链和47.27%的无规卷曲。
3.2.3 AbADC氨基酸序列与保守结构域分析用NCBI网站的BLAST服务器对AbADC1和AbADC2氨基酸序列和保守结构域进行分析（图 1）。结果表明，AbADC1氨基酸序列与马铃薯Solanum tuberosum L.（XP_006360614）的ADC序列一致性最高，为89%，其次为烟草Nicotiana tabacum L.（BAD06581），一致性为87%；AbADC2的氨基酸序列与曼陀罗Datura stramonium L.（AJ251898）的ADC序列一致性最高，达到90%，其次为马铃薯（XP_006359602.1）的ADC，一致性为87%。结构域预测发现AbADC包括2个保守的氨基酸结构域：ADC家族2磷酸吡哆醛结合位点和ADC家族2标记2序列[7]，分别负责结合吡哆醛磷酸盐和甲基丙烯酸十二氟庚酸（DFMA）的赖氨酸、半胱氨酸残基。
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图 1 来自不同植物的ADC氨基酸序列多重比对 Fig.1 Multi-alignment of amino acid sequences of ADC from other plants |
3.2.4 AbADC编码蛋白信号肽和亚细胞定位预测分析
利用Signal 4.1 Server网络服务器对AbADC1和AbADC2进行信号肽分析，AbADC1和AbADC2都不存在信号肽，属于胞质蛋白。利用WOLF POSRT网络服务器对AbADC1和AbADC2进行亚细胞定位分析，AbADC1主要定位于细胞质，AbADC2主要定位于细胞质膜。
3.2.5 AbADC分子进化树的构建将AbADC1和AbADC2蛋白的氨基酸序列与来源于其他植物和大肠杆菌的ADC蛋白氨基酸序列在CLUSTALK和MEGA4.1软件中进行进化树分析，以大肠杆菌的ADC作为系统树的外类群基于NJ的原理建树（图 2）。系统树可以分为2个主要分支，第一个主分支包括水稻和燕麦的单子叶序列；第二个分支包括茄科、十字花科和蔷薇科为代表的双子叶序列。由进化树可知AbADC1与番茄的ADC亲缘关系较近，而AbADC2与曼陀罗的ADC的亲缘关系较近。
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图 2 基于MEGA4.1软件平台用NJ方法构建AbADC分子进化树 Fig.2 Phylogenetic tree of AbADC from different organisms constructed by NJ method on MEGA 4.1 |
3.3 AbADC基因的组织表达和诱导表达分析
采用qRT-PCR技术对AbADC在颠茄花、叶、须根和主根等组织中的表达情况进行了分析，采用PGK作为内参基因（引物序列见表 1）。结果表明，AbADC1在须根中表达量最高，其次为主根和嫩茎（图 3）；AbADC2在主根中表达量最高，其次为须根、花蕊、花蕾和青果（图 3）。
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图 3 AbADC1和AbADC2在不同组织中的表达分析 Fig.3 Tissue-expression analyses of AbADC1 and AbADC2 using real-time PCR |
将黑暗培养1个月的发根分别进行盐胁迫处理（100 mmol/L NaCl）和4 ℃冷处理，qRT-PCR检测结果显示，在NaCl处理项中相比于对照组，AbADC1和AbADC2表达量在各时间点都有所降低，但无显著性的变化（图 4）。在4 ℃冷处理项，AbADC1表达量基本无变化；AbADC2在4、12、24 h 3个时间点的基因表达量都显著的降低（图 4）。
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图 4 不同处理下AbADC1和AbADC2基因表达 Fig.4 Expression of AbADC1 and AbADC2 in hair roots with different treatments |
4 讨论
ADC是多胺合成途径上的一个关键酶，其催化产物腐胺也是尼古丁和托品烷类生物碱生物合成的前体物质。本实验采用RACE技术获得了颠茄中的2个ADC基因AbADC1和AbADC2，蛋白质结构域分析表明AbADC属于磷酸吡哆醛依赖性酶（PLPDE）家族Ⅲ型PLPDE亚家族成员，具有2个保守结构，ADC家族2磷酸吡哆醛结合位点和ADC家族2标记2序列，这2个保守的功能域在所有原核和真核生物中普遍存在。
组织表达谱显示AbADC1主要在须根中表达，AbADC2主要在主根中表达，AbADC1和AbADC2在茎和叶片中的表达量都较低，这与已经报道[7]的其他物种中同源基因的表达模式并不相同。在棉花中，ADC在叶片组织中的表达量远远高于根部和茎部，且在所检测的3个组织中根中的表达量最低[7]；在桃树中，ADC在根和老叶中表达量最低而在嫩枝和幼嫩叶片中的表达高于花和茎[9]；在拟南芥中，AtADC1为组成性表达，AtADC1仅在莲座叶和角果中表达，并对多种非生物胁迫有响应[12]；在芥菜中，ADC主要在根和茎中表达，在叶片中几乎不表达[13]。托品烷类生物碱主要在根部合成，预示着颠茄ADC与生物碱的合成有一定的关系，也说明同源蛋白间组织表达的差异，可能与其参与的功能相关。
许多植物的ADC表达量会受不同诱导因素的影响，本研究中，仅AbADC2在冷处理后表达量出现下调，在盐胁迫下均略有降低；AbADC1的表达量在2种处理中均无显著变化，这与该基因在黄瓜[14]、森林草莓[15]、拟南芥[16]和芥菜[13]等植物中的表达情况并不相同。在低温处理的黄瓜幼苗中，ADC活性有一定的提高。冷、盐胁迫后的森林草莓中，FvADC表达量均出现上调。拟南芥ADC1在受到盐胁迫后基因表达量显著提高，而ADC2并无明显变化。同样，受盐胁迫后的芥菜中，ADC3表达量也显著提高，但是ADC1和ADC2表达量并无变化。根据本实验的结果，AbADC2是低温胁迫响应基因，而AbADC1和AbADC2都不是盐胁迫响应基因，推测颠茄中可能还存在另外一条或多条ADC基因，其表达受盐胁迫响应。此外，AbADC1和AbADC2是否对颠茄中生物碱的合成有重要影响还有待进一步研究。在后期的工作中，将分别构建AbADC的超表达和干扰载体，并导入颠茄获得转基因发根和植株，在代谢水平上进一步研究AbADC的功能及其对TAs生物合成的影响。
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