党参Codonopsis Radix为桔梗科植物党参Cdoonopisis pilosula (Farnch.) Nannf，素花党参Codonopsis pilousla Nannf. var.modesta (Nannf.) L. T. Shen或川党参Codonopsis tangshen Oliv. 的干燥根，其主要功效为补中益气、健脾益肺，主治脾肺虚弱、气短心悸、内热消渴^[1-2]等症。党参多糖（CPP）为党参的主要成分之一，临床药理实验表明，CPP具有清除自由基、调节机体免疫力、抗衰老和造血的功能，临床上广泛用于调血脂、降血糖、抗衰老等^[3-6]。目前国内和国外对CPP的研究集中在多糖提取工艺的优化^[7-10]，对多糖进一步的分离纯化以及活性研究还需要更深入的探索。本实验主要结合多糖得率和多糖的量，以多糖的提取率为指标，对CPP的提取工艺进行优化，得到提取效率较高的工艺，然后通过对多糖相对分子质量（M）测定方法的研究，得到粗多糖的单糖组成和M分布情况，为CPP的进一步分级研究奠定基础。

1 仪器与材料

CP225D电子天平，德国sartorius公司；FZ102微型植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；2695型高效液相色谱仪，美国Waters公司，示差折光检测器，GPC色谱工作站；Mill-Q超纯水制备系统，德国Merck公司；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

党参，购自济南漱玉平民大药房，经山东中医药大学田景振教授鉴定为桔梗科植物党参Cdoonopisis pilosula (Farnch.) Nannf的干燥根；D-氨基半乳糖（批号1015126，质量分数≥98%）、D-核糖（批号140668，质量分数≥98%）对照品，德国Dr. Ehrenstorfer公司；D-甘露糖（批号140651- 201402，质量分数≥98%）、L-鼠李糖（批号111683- 201401，质量分数≥98%）、D-葡萄糖醛酸（批号140648-201402，质量分数≥98%）、D-半乳糖醛酸（批号111646-201201，质量分数≥98%）、D-葡萄糖（批号110833-201205，质量分数≥98%）、D-半乳糖（批号100226-201204，质量分数≥98%）、D-阿拉伯糖（批号111506-200001，质量分数≥98%）、D-木糖（批号111508-200404，质量分数≥98%）、系列M右旋糖酐对照品，D-2（批号140639-201203，M 5 250）、D-4（批号140641-201203，M 13 050）、D-5（批号140640-201203，M 36 800）、D-7（批号140644- 201203，M 135 350），购自中国食品药品检定研究院；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果 2.1 供试材料的处理

根据预试验结果，取党参药材，在60 ℃真空干燥至恒定质量后粉碎，过65目筛，得党参药材干粉。取党参药材干粉500 g，置圆底烧瓶中，加入3倍体积的石油醚（30～60 ℃，脱脂液），加热回流5 h，倾去提取液，再次加入3倍体积的石油醚（30～60 ℃），回流提取5 h，重复操作3次，至样品提取液澄清为止。弃去提取液，取滤渣，置通风橱中挥干溶剂，置于60 ℃电热恒温干燥箱中烘干，得除去油脂的党参粉末。将脱脂后的党参粉末置圆底烧瓶中，加入3倍体积的95%乙醇溶液，回流提取6 h，弃去提取液，循环重复3次，取滤渣，置于60 ℃电热恒温干燥箱干燥，得除去低聚糖的党参粉末。

2.2 党参多糖定量测定

参考文献方法^[11-12]，以葡聚糖（M 10 000）为对照品，采用苯酚-浓硫酸比色法测定多糖的量。

多糖提取率＝粗多糖的质量/党参生药的质量

2.3 单因素试验

取党参药材干燥至恒定质量后，粉碎过筛，经石油醚，95%乙醇提取，去除脂溶性成分和低聚糖，挥干溶剂后，采用水提醇沉法提取CPP。固定其他条件不变，分别考察料液比、提取温度、提取时间、提取次数对多糖提取率的影响。

2.3.1 料液比对CPP提取率的影响

固定提取温度85 ℃、提取时间为1 h，提取次数1次，改变料液比（1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶20）提取CPP，进行料液比单因素试验。结果CPP提取率分别为（8.7±1.0）%、（13.9±1.5）%、（18.5±1.7）%、（17.9±2.3）%、（16.4±1.8）%、（15.5±1.2）%（n＝3）。料液比从1∶5增加到1∶10时，多糖得率呈明显上升趋势，从1∶10增加到1∶20时，多糖得率虽然有所降低，但变化趋势较为平稳，因此选取料液比为1∶8、1∶10、1∶12对CPP提取作正交试验，以确定最佳料液比。

2.3.2 提取温度对CPP提取率的影响

固定料液比1∶10、提取时间1 h，提取次数1次，改变提取温度（55、65、75、85、95 ℃）提取CPP，进行提取温度单因素试验。结果CPP的提取率分别为（8.7±1.0）%、（10.3±0.9）%、（14.7±1.3）%、（17.6±1.9）%、（16.1±1.2）%（n＝3）。提取温度从55 ℃增加到85 ℃时，多糖得率呈上升趋势，从85 ℃增加到95 ℃时，多糖得率有所降低，因此选取75、85、95 ℃对CPP提取作正交试验，以确定最佳提取温度。

2.3.3 提取时间对CPP提取率的影响

固定提取温度85 ℃、料液比1∶10，改变提取时间（0.5、1、1.5、2、3、4 h）提取CPP，进行提取时间单因素试验。结果发现CPP提取率分别为（13.5±1.2）%、（18.4±0.9）%、（19.3±1.6）%、（18.8±1.8）%、（16.1±1.3）%、（14.3±1.1）%（n＝3）。随着提取时间的延长，多糖得率呈上升趋势，但提取时间超过2 h，多糖得率有所降低，因此选取1、1.5、2 h对CPP提取作正交试验，以确定最佳提取时间。

2.3.4 提取次数对CPP提取率的影响

固定提取温度85 ℃、提取时间为1 h，料液比1∶10，改变提取次数（1、2、3、4、5）提取CPP，进行提取次数单因素试验。结果CPP提取率分别为（13.5±1.2）%、（18.4±1.3）%、（19.3±0.9）%、（18.8±1.0）%、（16.1±1.2）%（n＝3）。随着提取次数的增多，多糖得率呈上升趋势，但提取2次后，再增加提取次数，多糖提取率变化不大，因此选取1、2、3次对CPP提取作正交试验，以确定最佳提取次数。

2.4 正交试验设计与分析

根据单因素及预试验结果选定水提时影响CPP提取率的4个主要因素提取次数（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取温度（D）作为考察因素，以CPP的提取率为考察指标，选用L₉(3⁴) 正交表进行试验，各组上清液分别浓缩至100 mL，加乙醇至80%沉淀，冰箱静置过夜，离心。醇沉物分别用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗1次，40 ℃真空干燥至恒定质量，测定CPP的提取率^[13-14]。试验设计及结果见表 1。方差分析见表 2。

由表 1、2可知，各因素对多糖提取率的影响大小依次为D＞A＞C＞B，最优组合为A₂B₂C₃D₂，即确定CPP的最佳提取工艺为将党参药材干燥至恒质量，粉碎后，在提取温度为85 ℃，料液比为1∶12，提取时间为1.5 h的情况下提取2次。在最佳条件下进行3次平行实验，多糖提取率分别为22.47%、22.18%、23.02%，平均提取率为22.57%。

2.5 CPP的纯化

取党参水提液，浓缩至100 mL，加乙醇至80%沉淀，冰箱静置过夜，离心，取醇沉物于40 ℃真空干燥至无乙醇，加入10倍量蒸馏水，搅拌溶解，向多糖溶液中加入Sevage试剂（氯仿-正丁醇4∶1），至终体积分数为20%，超声15 min，在4 500 r/min下，离心15 min。收集上清液，再次加入Sevage试剂，重复上述步骤，直至无变性蛋白沉降为止，得到澄清的多糖溶液。

取CPP溶液，于以DE-52纤维素为填充剂的玻璃柱上，先用0.5 mol/L NaCl溶液脱液，再使用1 mol/L NaCl洗脱多糖样品，收集洗脱液，用苯酚-浓硫酸法检测洗脱液中多糖的量，直至无多糖检出为止，浓缩洗脱液。将浓缩后的CPP洗脱液灌入透析袋中，再用封口夹密封透析袋另一端口，24 h自来水循环透析，以除去多糖中的色素和洗脱后残留NaCl及其他的小分子物质。将透析后的多糖旋蒸浓缩，将浓缩后的多糖溶液装入5 mL西林瓶中，多糖液面不可超过西林瓶高的1/4，防止真空冷冻干燥过程中多糖的逸出，放入−8 ℃冰箱中预冷冻16 h；再放入真空冷冻干燥机24 h，得到CPP的干燥样品^[15-17]。

2.6 HPLC测定CPP水解产物的单糖组成 2.6.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbox SB-C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为磷酸盐缓冲溶液（pH 8.2）-乙腈（83∶17）；体积流量1.0 mL/min；检测波长为245 nm；柱温35 ℃。

2.6.2 混合单糖对照品溶液的配制

精密称取一定量的10种单糖对照品，加超纯水溶解并定容，得到混合对照品溶液（D-甘露糖0.340 mg/mL、L-鼠李糖0.411 mg/mL、D-葡萄糖醛酸0.298 mg/mL、D-半乳糖醛酸0.231 mg/mL、D-葡萄糖0.451 mg/mL、D-半乳糖0.198 mg/mL、D-木糖0.315 mg/mL、D-氨基半乳糖0.219 mg/mL、D-核糖0.342 mg/mL、D-阿拉伯糖0.257 mg/mL）。

2.6.3 多糖的水解样品的制备^[18]

准确称取多糖0.5 g，置于带塞的试管内，加入10 mL 1 mol/L的H₂SO₄于沸水浴中水解8 h，用高纯水代替1 mol/L的H₂SO₄，于沸水浴中2 h作为空白对照。水解结束后，将水解液和空白对照于10 000 r/min离心10 min。取水解液4.5 mL用2 mol/L的NaOH中和至pH值为7，并定容至10 mL，10 000 r/min，离心10 min，取上清液待衍生化。

2.6.4 柱前衍生化处理^[19]

取多糖水解样品溶液和混合对照品溶液各50 μL，分别与50 μL 0.5 moL/L的PMP甲醇溶液及50 μL 0.3 mol/L的NaOH溶液涡旋混合30 s，在70 ℃条件下反应30 min，冷却至室温，加入50 μL 0.3 mol/L的HCl进行中和并加入100 μL高纯水稀释混匀，加入900 μL氯仿涡旋混匀30 s静置5 min，吸取下层液弃去。从“加入900 μL氯仿”起重复操作3次，即得衍生化样品。

2.6.5 样品的测定

取衍生化后的样品溶液和对照品溶液各10 μL，进样，测定。

2.6.6 CPP水解产物的单糖组成测定结果

结果显示CPP主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、木糖和少量甘露糖组成。单糖对照品溶液色谱图见图 1-A，多糖水解产物的HPLC图见图 1-B。

2.7 高效凝胶色谱（HPGPC）法测定CPP平均M 2.7.1 色谱条件

色谱柱为Shodex OHPak SB-803 HQ（300 mm×8.0 mm，10 μm），流动相为0.71%硫酸钠溶液（内含0.02%叠氮钠），柱温35 ℃，示差折光检测器（检测器温度35 ℃），体积流量0.5 mL/min，进样量20 μL。

2.7.2 对照品溶液的制备

取右旋糖酐D2、D4、D5、D7对照品适量，精密称定，加流动相分别制成1.5 mg/mL的溶液，即得。

2.7.3 供试品溶液的制备

取CPP适量，加流动相制成约含10 mg/mL的溶液，振摇，室温放置过夜，作为供试品溶液。

2.7.4 标准曲线的制备

取上述右旋糖酐系列对照品溶液分别进样，记录洗脱峰的保留时间，由GPC专用软件^[5]绘制标准曲线，以对照品M的对数值为纵坐标（Y），以相应色谱峰的保留时间为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程Y＝−0.328 9 X＋8.868 5，R²＝0.999 5。

2.7.5 样品测定

根据GPC专用软件绘制的标准曲线及供试品的保留时间，采用GPC专用软件计算样品各组分的重均相对分子质量（M_w）及其M分布。HPGPC结果见图 2。

2.7.6 CPP的平均M测定结果

取多糖样品，平行测定6份，取其平均值。其结果显示M_w为21 498，RSD为2.12%，数均相对分子质量（M_N）为11 730，RSD为1.98%。

3 讨论

本研究在单因素试验的基础上采用正交设计对CPP的提取方法进行优化，并采用柱前衍生HPLC法和HPGPC法对CPP水解后的单糖组成和M进行研究。结果表明，CPP的最佳提取工艺为党参药材经干燥、粉碎，然后经过石油醚脱脂，95%乙醇脱去低聚糖，挥干溶剂，在提取温度为85 ℃，料液比为1∶12，提取时间为1.5 h的情况下提取2次，CPP的提取率达到22.57%。将上述CPP经过脱蛋白、脱色、透析和冷冻干燥处理得到精制多糖，采用HPLC法对CPP单糖组成进行分析，结果显示CPP主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、木糖和少量甘露糖组成；以不同M的右旋糖酐为对照品，经GPC软件处理，测定CPP的M_w为21 498，共得到4个组分。研究表明^[20-21]，CPP具有清除自由基、调节机体免疫等功能，是一种具有极大开发利用价值有效部位。本实验对CPP的提取方法、单糖组成和M分布进行了研究，对CPP的提取提供理论依据，并为CPP的分级和活性研究提供了物质基础。