2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.14.025 |
2. 贵阳中医学院, 贵州 贵阳 550002 ;
3. 上海海天医药科技开发有限公司, 上海 200023
2. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China ;
3. Shanghai Haitian Pharmaceutical Science and Technology Co., Ltd., Shanghai 200023, China
飞龙掌血Toddaliae Asiaticae Radix为芸香科（Rutaceae）植物飞龙掌血Toddalia asiatica (L.) Lam.的干燥根。四季可采挖，切段，洗净，晾干。其为贵州省少数民族用药，具有祛风止痛、散瘀止血、消肿解毒的功效，用于风湿痹痛、胃痛、吐血、衄血、跌打损伤、刀伤出血、痛经、闭经牙龈出血、口舌生疮[1]。飞龙掌血在不同的地方标准中规定略有不同，云南省中药材标准（2005版）（第四册彝族药）规定，飞龙掌血为芸香科植物飞龙掌血Toddalia asiatica (L.) Lam.的干燥茎[2]；然而，湖南省中药材标准（2009版）规定，飞龙掌血为芸香科植物飞龙掌血的干燥根[3]；与此同时，广西中药材标准第二册规定，飞龙掌血为芸香科植物飞龙掌血干燥根及茎[4]。
根据现行各地方标准，飞龙掌血的用药部位主要包括了根及茎，上述各地方标准及相关研究[5-8]表明，其根与茎均可入药，且具有相同药理活性的可能。为加强中药资源的保护和可持续利用，保护中药种质和遗传资源，加强中药新品种研究，确保中药材可持续发展，研究飞龙掌血根皮与茎皮指纹图谱的相似性具有重要的理论和现实意义。本研究采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）》分析根皮与茎皮指纹图谱的相似度，从而了解根皮与茎皮化学组成的差异，为促进飞龙掌血综合利用提供理论依据，进而提高该品种的利用度，达到中药资源保护及可持续利用的目的。
1 仪器和材料 1.1 仪器与设备岛津LC-20AD型高效液相色谱仪，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC Solution工作站；超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；岛津AUW120D型电子天平（十万分之一）。
1.2 材料与试剂飞龙掌血根皮对照药材（批号121410-200701），白屈菜红碱对照品（批号111718-200501），均购于中国食品药品检定研究院。冰醋酸、磷酸为分析纯，甲醇、乙腈、异丙醇为色谱纯，水为重蒸馏水。供试品由贵阳新天药业股份有限公司提供，所采集各批次药材经贵阳中医学院周汉华教授鉴定为飞龙掌血Toddalia asiatica (L.) Lam.根皮和茎皮，药材产地及采收季节见表 1。飞龙掌血茎皮照飞龙掌血根皮质量标准（《贵州省中药材、名族药材质量标准（2003版）》，DB52/YC059-2003，P63）检验合格[1]。
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表 1 药材产地及采收季节 Table 1 Origins and collecting seasons of T. asiatica |
2 方法 2.1 色谱条件
色谱柱为Hypersil GOLD ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相[9-11]采用乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）系统进行梯度洗脱，程序为0～5 min，15% A；5～30 min，15%～80% A；30～35 min，80% A；35～37 min，80%～15% A；37～50 min，15% A；检测波长269 nm；体积流量1.0 mL/min。白屈菜红碱保留时间为23.6 min，50 min内色谱峰全部检出。
2.2 对照品溶液及对照药材的制备精密称取白屈菜红碱对照品适量，加60%乙醇溶解，定容至100 mL，即得。精密称取飞龙掌血根皮对照药材0.2 g，加60%乙醇超声提取1 h时，滤过，即得。
2.3 供试品溶液制备精密称取飞龙掌血根皮或茎皮粉末0.2 g，采用不同体积分数的乙醇50 mL超声提取1 h，提取液过0.45μm的微孔滤膜后吸取10μL，注入高效液相色谱仪观察，在使用60%乙醇提取时，能够得到较多的色谱峰，药材成分提取率高。采用60%乙醇50 mL提取0.5、1.0、1.5 h，提取液过0.45μm的微孔滤膜后吸取10μL，注入高效液相色谱仪，提取1.0 h得到的色谱峰与1.5 h的一致。故提取方法为精密称取飞龙掌血药材0.2 g，加60%乙醇50 mL超声提取1.0 h，滤过，即得。
3 结果与分析 3.1 方法学考察 3.1.1 精密度试验取批号为140723的飞龙掌血根皮粉末，按照“2.3”项方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。以8号峰白屈菜红碱的保留时间和峰面积为参照，计算样品中共有峰与白屈菜红碱的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为0～1.89%、0～0.38%，结果表明，精密度良好。
3.1.2 稳定性试验取批号为140723的飞龙掌血根皮粉末，按照“2.3”项方法制备供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、18、21 h进样，记录色谱图。以8号峰白屈菜红碱的保留时间和峰面积为参照，计算样品中共有峰与白屈菜红碱的相对峰面积与相对保留时间RSD分别为0～2.78%、0～2.21%。结果表明，稳定性良好。
3.1.3 重复性试验取批号为140723的飞龙掌血根皮粉末，按照“2.3”项方法制备样品，同时制备6份，记录色谱图。以8号峰白屈菜红碱的保留时间和峰面积为参照，计算样品中共有峰与白屈菜红碱的相对峰面积和相对保留时间RSD分别为0～1.69%、0～0.32%。
3.2 指纹图谱建立 3.2.1 共有峰的标定采用不同产地，不同采收季节的飞龙掌血根皮或茎皮，依“2.3”项制备供试品溶液，测定。取“2.2”项对照药材溶液，按照“2.1”项色谱条件测定，得到对照指纹图谱，并标定9个色谱峰为共有指纹峰，见图 1，根皮与茎皮指纹图谱见图 2。共有峰相对保留时间与相对峰面积见表 2和表 3。
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图 1 飞龙掌血根皮与茎皮对照图谱 Fig.1 Fingerprints of root barks and stem barks of T. asiatica |
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图 2 不同批次飞龙掌血根皮与茎皮的指纹图谱 Fig.2 Fingerprints of root barks and stem barks of different batches of T. asiatica |
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表 2 飞龙掌血根皮与茎皮指纹图谱共有峰相对保留时间 Table 2 Relative retention time of common peaks for fingerprint of root barks and stem barks of T. asiatica |
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表 3 飞龙掌血根皮与茎皮指纹图谱共有峰相对峰面积值 Table 3 Relative areas of common peaks for fingerprint of root barks and stem barks of T. asiatica |
结果表明，不同产地及不同季节采集的飞龙掌血根皮与茎皮共有峰的相对保留时间相对一致，但相对峰面积差异较大，说明产地和季节的不同会导致相关物质活性成分的量有一定的差异。
3.2.2 相似度计算采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）》分析[9]，对照图谱生成方法为中位数，时间窗宽度0.5，多点校正，全峰匹配，相似度结果见表 4。由此结果可见，不同产地、不同季节采收的飞龙掌血根皮及茎皮指纹图谱相近，相似度均大于0.90，表明其成分相近。
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表 4 相似度评价结果 Table 4 Evaluation of similarity |
4 讨论
根据文献报道进行实验[10-12]，结果表明，有大量色谱峰较早被洗脱，且未能有效分离，故本研究调整流动相，将洗脱方式从等度洗脱改为梯度洗脱。调整后的结果显示，不仅共有峰数量较多，且各色谱峰间分离度较好，因而有利于不同产地不同季节采收的根皮及茎皮指纹图谱对比研究。同时，对样品进行3D图像考察，各峰在269 nm处均有较强的吸收，且多个峰均有最大吸收，故分析波长定为269 nm。为充分提取药材中有效物质成分，因而本研究
还对前处理方法进行系统研究，不同体积分数的乙醇提取效果表明，采用60%的乙醇提取，色谱峰较为丰富，峰面积较大，同时，考察提取时间为0.5、1.0、1.5 h的结果表明，提取时间为1.0 h时白屈菜红碱峰面积与1.5 h的相近，因此，最优提取方式为60%的乙醇提取1.0 h。
虽有相关文献研究了飞龙掌血的指纹图谱[11-12]，但迄今并未有根皮与茎皮的指纹谱图相似性进行对比研究报道，然而，较多的中成药成方制剂是采用飞龙掌血根皮入药，若茎皮能替代根皮入药将极大促进了中药资源的可持续发展。本研究结果表明，飞龙掌血根皮与茎皮化学组成相近，因此，此研究为飞龙掌血茎皮替代根皮的使用提供理论依据，进而为提高飞龙掌血的利用率，促进野生资源的合理利用具有非常重要的意义。
| [1] | 贵州省中药材、民族药材质量标准[S]. 2003. |
| [2] | 云南省中药材标准[S].第四册. 2007. |
| [3] | 湖南省中药材标准[S]. 2009. |
| [4] | 广西中药材标准[S].第二册. 1996. |
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