土壤盐渍化是影响农作物产量和质量的主要环境因子之一。最近几年，由于盲目过量地使用肥料以及栽培过程中高温高湿的特殊环境，导致了土壤的次生盐渍化^[1]，严重威胁着农业生产和生态环境^[2-3]。山药Dioscorea opposita Thunb.为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属Dioscorea L.多年生攀缘性草本植物，在国内外享有盛誉，如瑞昌市的瑞昌山药、南城县的南城淮山、永丰县的永丰淮山、广丰县的广丰千金薯等^[4]。瑞昌山药为江西瑞昌市的传统特色蔬菜产品，是一种药食两用兼优的上等佳品，素有“江南人参”之誉^[5]。南城淮山在南城县也有1 300多年的栽培历史，2011年获批为国家地理标志农产品，肉质较密，口感细腻紧实，具有良好的药用价值和优良的鲜食品质^[6]。永丰淮山，药食兼优，食用，嫩滑爽口，风味独特；药用，健脾养胃、补中益气、滋补肝肾^[7]。广丰千金薯是广丰县传统名优地方品种，其肉质幼嫩、香甜爽口，具有健脾、助消化、补虚劳、益气、祛痰等功效，闻名省内外，深受消费者青睐^[8]。微型块茎，俗称零余子或珠芽，是指在山药腋芽处形成的变态块茎^[9]，可以用作繁殖材料，具有移栽成活率高、易保存、运输方便、生产成本低、便于优良品种的推广应用等优点^[10-11]。目前，国内外对于山药微型块茎的离体诱导形成^[11-12]、愈伤组织诱导^[13]、化合物提取工艺^[14]、药理学效应^[15]、休眠破除^[16-17]等方面的研究报道较多，但对山药微型块茎萌发苗胁迫生理方面的研究少见报道。在国外，Jaleell等^[18]和Wheatley等^[19]对白山药Dioscorea rotundata cv.Sree Priya微型块茎萌发苗和参薯Dioscorea alata L.试管苗的盐胁迫进行了研究。本实验将以江西地方山药（瑞昌山药、南城淮山、永丰淮山和广丰千金薯）微型块茎为材料，用氯化钠模拟盐胁迫条件，探讨盐胁迫对江西地方山药微型块茎萌发苗的影响，为江西地方山药的耐盐机制研究与耐盐育种提供参考，也为促进江西地方山药产业的可持续发展提供理论依据。

瑞昌山药微型块茎取材于江西瑞昌市南阳乡，南城淮山微型块茎取材于江西南城县建昌镇，永丰淮山微型块茎取材于江西永丰县坑田镇，广丰千金薯微型块茎取材于江西广丰县五都镇。4种样品经上饶师范学院生命科学学院洪森荣副教授鉴定为山药Dioscorea opposita Thunb.的微型块茎，俗名为“瑞昌山药”“南城淮山”“永丰淮山”和“广丰千金薯”，放于带透气PP塑料盖的兰花玻璃瓶中，置于4℃冰箱中保存备用。

微型块茎在4℃冰箱中保存至第2年4月初时取出，并挑选外形大小一致的微型块茎，用1% NaClO消毒10 min后，无菌水清洗3遍，然后用吸水纸吸去微型块茎表面浮水，播种于35 cm×25 cm×4 cm（长×宽×高）的不锈钢托盘中，内垫3层滤纸，每盘50粒，微型块茎上面覆盖蛭石。每天往托盘里添加MS基本培养液。播有微型块茎的托盘均置于光照培养箱中培养，温度为（25±1）℃，光照12 h/d，光强1 500～2 000 lx。

培养30 d时，微型块茎大多已经萌发，可以挑选芽长和根长大致相同的微型块茎，将其移栽到装有蛭石的花钵中，花钵底部放一托盘（便于储存花钵中流出的培养液），花钵和托盘一起放入光照培养室培养，温度为（25±1）℃，光照12 h/d，光强1 500～2 000 lx。每天用MS基本培养液对微型块茎进行浇灌，当山药幼苗长到15～20 cm时便开始进行盐胁迫处理。每天浇灌1次含有不同浓度NaCl的MS基本培养液。NaCl浓度设置为0（蒸馏水对照）、50、100、200、300 mmol/L，并测定流出托盘中培养液的电导值，使其与配制的培养液的电导值保持恒定（无差异性差异），以保持处理期间NaCl浓度的一致性^[20]。微型块茎在花钵中盐胁迫30 d后，取不同处理的山药幼苗相同部位新鲜叶片和根系测定其10项生理生化指标：根系活力（RA）采用氯化三苯基四氮唑还原法^[21]测定。总叶绿素（Chl）量采用丙酮比色法测定^[21]。可溶性蛋白（SP）量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定^[21]。可溶性总糖（TSS）量采用蒽酮比色法测定^[21]。Pro量采用酸性茚三酮法测定^[21]。丙二醛（MDA）量采用硫代巴比妥酸比色法测定^[21]。质膜透性（PMP）采用相对电导率法测定^[21]。过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定^[21]。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑法测定^[21]。过氧化氢酶（CAT）活性采用高锰酸钾滴定法测定^[21]。

以上实验均重复3次，本实验所有数据表示为x±s，数据用SPSS 19.0软件进行One-Way ANOVA分析，再进行LSD法检验，P＜0.05为有统计学差异显著性。根据鱼小军等^[3]的方法利用模糊数学隶属函数公式对试验原始数据进行定量转换。先利用公式X(μ)＝(X-X_min)/(X_max-X_min)计算每个处理的RA、Chl、SP、TSS、Pro、MDA量、PMP、POD、SOD和CAT活性在盐胁迫下的具体隶属函数值（式中，X为江西地方山药某一品种某一抗旱指标的测定值，X_max和X_min分别为江西地方山药4个品种中该指标的最大值和最小值），然后把每一指标在不同盐胁迫下的隶属值累加求平均值，最后把江西地方山药某一品种各耐盐指标隶属函数值累加求平均值，根据江西地方山药某一品种平均隶属函数值大小评价其耐盐性强弱，平均值越大，耐盐性越强，反之，耐盐性越弱。然后再用SPSS 19.0软件对各指标隶属函数值进行标准化处理，并对标准化值进行主成分分析及聚类分析，最后对供试的4个江西地方山药的耐盐性强弱进行综合评价。

通过用氯化钠模拟盐胁迫条件，本实验研究了盐胁迫对江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的影响。结果表明，不同NaCl浓度对江西地方山药微型块茎萌发苗10项生理生化指标（RA、Chl、SP、TSS、Pro、MDA量及PMP、POD、SOD、CAT活性）的影响也不同（图 1）。对于Chl量和RA而言，0～300 mmol/L盐胁迫下江西4种山药微型块茎萌发苗均呈显著下降的趋势。对于SP量而言，0～300 mmol/L盐胁迫下瑞昌山药、南城淮山和广丰千金薯微型块茎萌发苗的SP量呈先增后降的态势，而永丰淮山微型块茎萌发苗的SP量呈显著下降的趋势。对于TSS、Pro和MDA量以及PMP而言，0～300 mmol/L盐胁迫下江西4种山药微型块茎萌发苗均呈显著增加的趋势。对于POD、SOD和CAT活性而言，0～300 mmol/L盐胁迫下江西4种山药微型块茎萌发苗活性均呈先增后降的趋势。

图 1 盐胁迫对江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的影响 Fig.1 Effects of salt stress on physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers

通过盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗的RA、Chl、SP、TSS、Pro、MDA量及PMP、POD、SOD活性和CAT活性的隶属函数分析，对江西地方山药微型块茎萌发苗的耐盐性进行评价（表 1）。结果表明，广丰千金薯、永丰淮山、瑞昌山药和南城淮山的平均隶属函数值依次下降。因此，根据隶属函数分析，江西地方山药微型块茎萌发苗的耐盐性从强到弱为广丰千金薯＞永丰淮山＞瑞昌山药＞南城淮山。

表 1(Table 1)

表 1 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的隶属函数分析 Table 1 Subordinate function analysis of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress 山药品种 隶属函数值 平均隶属函数值 排序 Chl RA SP TSS Pro MDA PMP POD SOD CAT 南城淮山 0.592 0.646 0.419 0.252 0.406 0.236 0.541 0.293 0.286 0.355 4.026 4 广丰千金薯 0.604 0.508 0.573 0.498 0.652 0.530 0.376 0.421 0.472 0.471 5.105 1 瑞昌山药 0.394 0.752 0.363 0.489 0.198 0.152 0.514 0.554 0.546 0.206 4.168 3 永丰淮山 0.360 0.663 0.661 0.544 0.328 0.301 0.314 0.196 0.375 0.579 4.321 2

表 1 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的隶属函数分析 Table 1 Subordinate function analysis of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress

通过SPSS 19.0软件对各指标隶属函数值进行标准化处理，并对标准化值进行主成分分析（表 2）。结果表明，虽然江西地方山药微型块茎萌发苗各项生理生化指标之间相关性表现为不显著，但有些单项指标之间（如POD活性与Chl量、CAT活性与Chl量、TSS量与RA、MDA量与SOD活性）还是具有一定的相关性。

表 2(Table 2)

表 2 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的相关系数矩阵 Table 2 Correlation matrix of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress 指标 Chl RA SP TSS Pro MDA PMP POD SOD CAT Chl 1.000 −0.725 −0.145 −0.607 0.789 0.541 0.292 0.048 −0.320 −0.018 RA −0.725 1.000 −0.525 −0.024 −0.994 −0.965 0.439 0.201 0.158 −0.564 SP −0.145 −0.525 1.000 0.543 0.433 0.634 −0.964 −0.674 −0.211 0.975 TSS −0.607 −0.024 0.543 1.000 −0.051 0.284 −0.747 0.138 0.665 0.343 Pro 0.789 −0.994 0.433 −0.051 1.000 0.942 −0.344 −0.138 −0.153 0.480 MDA 0.541 −0.965 0.634 0.284 0.942 1.000 −0.608 −0.141 0.034 0.618 PMP 0.292 0.439 −0.964 −0.747 −0.344 −0.608 1.000 0.481 −0.051 −0.880 POD 0.048 0.201 −0.674 0.138 −0.138 −0.141 0.481 1.000 0.831 −0.800 SOD −0.320 0.158 −0.211 0.665 −0.153 0.034 −0.051 0.831 1.000 −0.419 CAT −0.018 −0.564 0.975 0.343 0.480 0.618 −0.880 −0.800 −0.419 1.000

表 2 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的相关系数矩阵 Table 2 Correlation matrix of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress

通过SPSS 19.0软件将江西地方山药的10项生理生化指标（RA、Chl、SP、TSS、Pro、MDA量及PMP、POD、SOD、CAT活性）转化为10个主成分（表 3）。结果表明，前3个主成分的贡献率分别为49.893%、28.471%和21.636%，它们的累计贡献率为100%。因此，选取前3个主成分作为江西4种地方山药耐盐性的重要主成分。

表 3(Table 3)

表 3 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的特征值和贡献率 Table 3 Eigenvalue and contribution rate of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress 主成分 初始特征值 特征值 贡献率/% 累计贡献率/% 1 4.989 49.893 49.893 2 2.847 28.471 78.364 3 2.164 21.636 100.000 4 3.249×10−16 3.249×10−15 100.000 5 1.598×10−16 1.598×10−15 100.000 6 1.191×10−16 1.191×10−15 100.000 7 7.180×10−18 7.180×10−17 100.000 8 −7.526×10−17 −7.526×10−16 100.000 9 −1.765×10−16 −1.765×10−15 100.000 10 −3.141×10−16 −3.141×10−15 100.000

表 3 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的特征值和贡献率 Table 3 Eigenvalue and contribution rate of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress

通过SPSS 19.0软件做出盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗10项生理生化指标的载荷图（图 2）。各项生理生化指标离中心越远，说明指标与主成分之间的相关系数越大。结果表明，CAT和SP 2个指标聚集在一起，PMP、POD和SOD 3个指标聚集在一起，Chl、Pro和MDA 3个指标也聚集在一起，这些均表明这些指标之间的亲疏关系。10项生理生化指标的成分矩阵（表 4）和成分得分系数矩阵（表 5）也表明，第1个主成分对应较大的指标有RA、SP、Pro、MDA量、PMP和CAT活性，说明耐盐能力较强的江西地方山药品种在盐胁迫下保持了一定的RA，PMP下降，MDA量减少，同时山药植株在盐胁迫下产生了较多的可以抵御盐害的SP和Pro，提高了CAT活性，使植株免受盐胁迫的伤害；第2个主成分对应较大的指标有Chl和TSS，说明耐盐能力较强的江西地方山药品种在盐胁迫下保持了一定量的叶绿素，同样产生了较多的可以抵御盐害的TSS；第3个主成分对应较大的指标有POD活性和SOD活性，说明耐盐能力较强的江西地方山药品种在盐胁迫下保持了较强的POD活性和SOD活性。

图 2 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标在主成分空间上的载荷图 Fig.2 Loading diagram in principal component space of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress

表 4(Table 4)

表 4 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的成分矩阵 Table 4 Component matrix of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress 指标 主成分 1 2 3 Chl 0.300 −0.938 0.173 RA −0.841 0.447 −0.305 SP 0.898 0.416 −0.145 TSS 0.298 0.829 0.473 Pro 0.781 −0.530 0.331 MDA −0.877 −0.217 0.429 PMP −0.813 −0.581 −0.051 POD −0.579 −0.087 0.810 SOD −0.284 0.410 0.867 CAT 0.917 0.257 −0.304

表 4 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的成分矩阵 Table 4 Component matrix of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress

表 5(Table 5)

表 5 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的成分得分系数矩阵 Table 5 Component score coefficient of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress 指标 主成分 1 2 3 Chl 0.060 −0.329 0.080 RA −0.169 0.157 −0.141 SP 0.180 0.146 −0.067 TSS 0.060 0.291 0.218 Pro 0.157 −0.186 0.153 MDA 0.176 −0.076 0.198 PMP −0.163 −0.204 −0.023 POD −0.116 −0.031 0.375 SOD −0.057 0.144 0.401 CAT 0.184 0.090 −0.140

表 5 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的成分得分系数矩阵 Table 5 Component score coefficient of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress

运用SPSS 19.0软件对隶属函数值进行处理，得到盐胁迫下江西4种地方山药的标准化值及其各主成分得分（表 6和7）。然后以每个主成分所对应的特征值占所提取主成分总的特征值之和的比例作为权重，计算江西4种地方山药的综合主成分值作为综合得分（表 7）。结果表明，在主成分1中，广丰千金薯得分第一，说明广丰千金薯在盐胁迫下保持了一定的RA，PMP减小，MDA减少，SP和Pro量以及CAT活性得到提高。在主成分2中，永丰淮山排名第一，说明永丰淮山在盐胁迫下其叶绿素量稳定，TSS量显著增加；在主成分3中，广丰千金薯再次排名第一，说明广丰千金薯在盐胁迫下保持了较强的POD活性和SOD活性。从综合得分来说，在盐胁迫下江西4种地方山药的耐盐性强弱顺序为广丰千金薯＞永丰淮山＞瑞昌山药＞南城淮山。这与模糊数学隶属函数法的评价结果一致。

表 6(Table 6)

表 6 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的标准化值 Table 6 Standard value of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress 山药品种 Chl RA SP TSS Pro MDA PMP POD SOD CAT 南城淮山 0.814 −0.619 −1.475 0.052 0.962 −0.469 −1.180 −0.299 −0.424 0.037 广丰千金薯 0.907 0.503 0.398 1.340 −0.553 0.354 0.461 0.427 1.390 −1.331 瑞昌山药 −0.728 −1.027 0.329 −1.037 0.714 1.209 1.114 −1.230 −0.942 1.088 永丰淮山 −0.992 1.144 0.748 −0.356 −1.122 −1.093 −0.395 1.102 −0.023 0.206

表 6 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的标准化值 Table 6 Standard value of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress

表 7(Table 7)

表 7 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的各主成分得分及综合得分 Table 7 Principal component scores and comprehensive score of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress 山药品种 主成分1 排序 主成分2 排序 主成分3 排序 综合得分 排序 南城淮山 −0.313 3 −1.138 4 −0.926 4 −0.680 4 4 广丰千金薯 0.948 1 −0.467 3 1.064 1 0.570 3 1 瑞昌山药 −1.267 4 0.488 2 0.638 2 −0.354 9 3 永丰淮山 0.631 2 1.117 1 −0.777 3 0.465 4 2

表 7 盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的各主成分得分及综合得分 Table 7 Principal component scores and comprehensive score of physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from Jiangxi yam microtubers under salt stress

根据盐胁迫下江西地方山药微型块茎萌发苗生理生化指标的Z值标准化的数据，用SPSS 19.0软件对江西4种地方山药进行聚类分析（图 3）。结果表明，盐胁迫下基于微型块茎萌发苗生理生化指标的Z值标准化数据，江西4种地方山药的耐盐性可以分成2类：广丰千金薯和永丰淮山为一类，为耐盐较强的品种；而南城淮山和瑞昌山药为另一类，为耐盐较弱的品种。

图 3 盐胁迫下江西地方山药基于微型块茎萌发苗生理生化指标的聚类分析树状图 Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of Jiangxi local yam based on physiological and biochemical indexes of seedlings germinated from microtubers under salt stress

植物的生长发育受环境条件的影响，而土壤盐渍化是影响植物生长的主要因素之一^[1]。大量实验证明，盐胁迫对植物光合作用具有抑制效应，而叶绿体是对盐胁迫比较敏感的细胞器，叶绿素量是直接反映光合强度的一个重要生理指标。黑果枸杞^[22]、四倍体泡桐^[23]和水飞蓟^[24]幼苗随着盐浓度的增大，叶绿素量显著减小。但低浓度盐胁迫对北沙参的叶绿素量影响不大，只有高浓度盐胁迫才会显著降低北沙参的叶绿素量^[25]。本实验结果与此基本一致。盐胁迫一般会造成活性氧（ROS）的大量积累，启动膜脂过氧化，MDA量随之升高，而SOD、POD和CAT等抗氧化酶系统可以清除ROS，减轻植物的盐害反应^[26]。但如果盐浓度过高，将会导致SOD、POD和CAT等抗氧化酶系统失去功能，MDA量随之升高，质膜完整性降低，PMP增加。黑果枸杞幼苗随着盐胁迫的加剧，POD活性均呈现“先上升，后下降”的变化趋势，MDA量和相对电导率显著增加，质膜的完整性显著下降^[22]。在盐胁迫下，水飞蓟幼苗SOD、POD和CAT活性先升高后降低，MDA量显著升高^[24]。这个结果与本实验结果相一致。但北沙参^[25]和四倍体泡桐^[23]幼苗随着盐胁迫浓度的增加其相对电导率、SOD活性和MDA量显著升高。盐胁迫还会引起植物体内渗透性物质量的变化。随着盐浓度的不断提高，四倍体泡桐^[23]和北沙参^[25]幼苗的SP量先升后降，而其可溶性糖和Pro量显著升高，这与本实验相一致。但水飞蓟幼苗在盐胁迫下可溶性糖量先升高后降低，MDA量显著升高，Pro量持续增加，SP和可溶性糖量先稳定后显著下降^[24]。因此，盐胁迫下植物体内的一些生理生化指标如RA、Chl、SP、TSS、Pro、MDA量及PMP、POD、SOD、CAT活性等一些与耐盐性密切相关的指标可作为耐盐性的评价指标。

但植物的耐盐性是许多性状相互作用的一种综合表现，不同植物由于其耐盐方式和耐盐机制不同，使得其生理代谢和生化变化也不同^[27]。采用隶属函数分析可以在多指标测定的基础上为植物品种的耐盐性提供一条综合评价的途径。在本实验中，根据隶属函数分析，江西地方山药微型块茎萌发苗的耐盐性从强到弱为广丰千金薯＞永丰淮山＞瑞昌山药＞南城淮山。目前，用隶属函数法对作物的抗逆性进行综合评价的研究较多，但由于植物逆境胁迫下的生理生化指标具有一定的相关性，仅用隶属函数法对植物的逆境抗性进行综合评价也存在一定局限性^[28]。主成分分析法在各指标间内在联系的基础上，克服了信息的重叠与指标的相关性，将原来多个且彼此相关的指标转换成新的、个数较少且彼此独立的综合指标，同时根据各自贡献率大小可以知道各综合指标的相对重要性^[29]。本实验利用主成分分析法将原来的10个生理生化指标综合成为3个主成分。在此基础上，求出江西地方山药4个品种的综合得分，继而对江西地方山药4个品种的耐盐性进行评价。结果表明，在盐胁迫下江西4种地方山药的耐盐性强弱顺序为广丰千金薯＞永丰淮山＞瑞昌山药＞南城淮山。这与与模糊数学隶属函数法的评价结果一致。本实验结果与玉簪^[28]、多年生黑麦草^[29]和紫花苜蓿^[30]抗旱性的隶属函数及主成分分析结果相一致。因此，利用隶属函数及主成分分析对植物的抗逆性进行综合评价，可以使得出的结论更为客观合理，在植物抗逆性的综合评价中具有重要的实践意义。

微型块茎作为山药快速繁殖的材料，尤其是利用脱毒苗获得的脱毒微型块茎更是山药优质种苗的重要来源^[31]。虽然脱毒微型块茎可以进行周年生产，但只有在播种季节可以规模化种植，因此，如何让生产出的脱毒微型块茎在播种季节统一高效的萌发，是规模化生产中需要解决的关键问题之一^[33]。大量研究表明，作物在种子萌发期和幼苗期对盐分最敏感，可在种子萌发期和幼苗期对大量材料进行耐盐性筛选^[34]。因此，通过挖掘江西地方山药种质本身的耐盐能力，筛选和培育出江西地方山药耐盐品种是实现江西山药脱毒种苗工厂化生产和大田种植最为经济有效的途径。