地榆Sanguisorbae Radix是蔷薇科地榆属植物地榆Sanguisorba officinalis L.的干燥根，在我国主要分布于江苏、湖南、安徽、甘肃、陕西等省^[1]。秦岭山脉地榆资源十分丰富。研究表明，地榆根中含鞣质约7%、三萜皂苷2.4%～4.0%，已分离出地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ（其苷元为19α-羟基乌苏酸）和地榆皂苷B及E（其苷元为乌苏酸）^[2]。地榆具有多种药用价值，能够凉血、止血、抗菌、解毒、止吐等。

现代药理及临床研究表明，以地榆为原料制备的地榆升白片能显著升高放、化疗引起的外周血白细胞减少^[3-4]，使癌症患者生活质量得到明显改善。通过用小鼠骨髓细胞体外筛选有效部位发现，地榆总皂苷具有明显的促骨髓细胞增殖作用^[5]。体内动物实验也证实，地榆总皂苷不仅能有效升高环磷酰胺（CTX）诱导的骨髓抑制小鼠骨髓有核细胞数量，同时对外周血白细胞、红细胞以及血小板数量也有明显的改善作用^[5-7]，这些研究结果均表明地榆具有明显的促造血作用。

本课题组前期已研究闪式提取^[8]结合三步碱沉法制备地榆总皂苷，在地榆总皂苷的基础上进行地榆皂苷类成分对CTX诱导的骨髓抑制小鼠骨髓作用以及对Baf3/Mpl、UT-7和NSF-60细胞的增殖作用研究，均表明地榆皂苷元具有较强的药理活性。

五环三萜皂苷类成分由于口服吸收较差以及机体代谢作用，致使其生物利用度普遍较低^[9-11]。大多数五环三萜皂苷主要经各种酶系、菌群等转化为苷元而产生生物活性^[12-13]。药物进入机体后，在各种酶、体液环境等影响下可发生一系列代谢反应，导致药物化学结构发生变化，其中主要包括肠道和肝脏代谢。

已有的研究表明，地榆皂苷类成分能够治疗骨髓抑制，而通过地榆皂苷类成分对CTX致小鼠骨髓抑制的保护作用研究表明地榆皂苷类成分可显著升高小鼠白细胞数目（WBC），显著升高小鼠骨髓DNA水平，显著促进CD34⁺和MGMT蛋白的表达。通过实验研究可以看出地榆皂苷类成分中地榆皂苷元比地榆皂苷更能够显著拮抗CTX所致小鼠骨髓抑制。

本实验在地榆总皂苷及其水解产物中分离得到地榆皂苷元，其中地榆皂苷元（3α, 19α-羟基乌索-12-烯-28-羧酸）是在地榆总皂苷制备及水解过程中产生的，在结合药理实验（体内及体外实验）中明确其能够显著升高CTX导致的小鼠骨髓抑制的白细胞数，对地榆药材采用系统溶剂法以及硅胶柱色谱梯度洗脱最终筛选地榆有效成分为地榆皂苷元成分，并通过药效学考察，初步确定其为保髓升白的有效成分，因此对其制备工艺的研究，能够为研制保髓升高白细胞数目新药的研究带来积极的意义。

同时本课题组已报道从地榆中分得的地榆总皂苷具有显著的升高白细胞活性，地榆总皂苷中含有的地榆皂苷-Ⅰ与地榆皂苷-Ⅱ均具有较强的药理活性，地榆皂苷-Ⅰ与地榆皂苷-Ⅱ的皂苷元均为同一个物质。所以，如果能够大量制备地榆皂苷元成分，以此为先导化合物进一步结构修饰，制备和寻求活性更强的保髓升高白细胞药物，对发现新的活性成分或半合成原料，扩大药用资源及进行创新药物的开发研究将具有十分重要的意义。

1 仪器与材料

Agilent1260型高效液相色谱仪，Agilent公司；BT25S型1/10万电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；JA2003型1/1000电子分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；BT25S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

乙腈、甲醇均为色谱级，Fisher Scientific公司；水为超纯水，其他试剂均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

地榆饮片，批号20141202，购自四川科伦药业股份有限公司，经成都中医药大学中药鉴定教研室卢先明教授鉴定为蔷薇科地榆属植物地榆Sanguisorba officinalis L.的干燥根。地榆皂苷元对照品，质量分数＞98%，实验室自制。

2 方法与结果 2.1 酸水解地榆总皂苷制备地榆皂苷元 2.1.1 地榆总皂苷制备工艺^[14-17]

取地榆饮片1 kg，适当粉碎后加8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，滤过，合并2次提取液，静置放冷后，调乙醇体积分数至90%，加10% NaOH溶液调pH值至12～14，静置过夜（12 h），离心去沉淀，滤液抽滤得到上清液。上清液减压浓缩至适当体积，加水适量至乙醇体积分数20%左右，用10% NaOH溶液调pH值至11～12，静置12 h，离心收集沉淀；上清液继续用10% NaOH溶液调pH值至12～13，静置12 h，离心收集沉淀；合并两侧沉淀，于70℃减压至干，用无水乙醇回流45 min，滤过，收集滤液，减压回收乙醇至有固形物析出，挥干，所得固形物减压干燥12 h，即得地榆总皂苷。

2.1.2 先碱水解后酸水解地榆总皂苷工艺

称取地榆总皂苷约1.0 g，加80倍量20% NaOH溶液，82℃下水浴3.5 h。取出，放冷到室温，加入10% HCl调pH值至6～7，再用纯净水洗至中性，抽滤，滤出水解产物（白色沉淀），水解得到的产物为地榆皂苷-Ⅱ为主的地榆总皂苷（地榆皂苷-Ⅱ＞80%），沉淀于烘箱中70℃干燥4 h，即得地榆总皂苷（以地榆皂苷-Ⅱ为主）；称取碱水解后地榆总皂苷（地榆皂苷-Ⅱ为主）0.2 g，分别置50 mL量瓶中，加入4 mol/L的盐酸溶液，在92℃下水浴回流时间为30 min，取出，放冷到室温，加入等体积氯仿萃取2次，静置分层，下层于水浴锅上挥干。沉淀于烘箱中70℃干燥4 h，再置干燥器中30 min后取出称质量，称得产物干质量为0.19 g，其质量作为考察指标。酸水解地榆总皂苷得到的产物为地榆皂苷元。

2.2 地榆皂苷元的转化率测定

将得到的定量碱水解后的地榆总皂苷酸水解获得地榆皂苷元，按照公式计算地榆皂苷元转化率（转化率=地榆皂苷元质量分数×水解产物干质量/总皂苷取样量）。

2.3 地榆皂苷元的定量测定 2.3.1 色谱条件

Agilent extend-C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.5%磷酸水溶液（70：30）；体积流量0.8 mL/min；柱温40℃；检测波长205 nm，进样量10μL。

2.3.2 对照品溶液的配制

精密称取地榆皂苷元对照品5.12 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解至刻度，摇匀，超声30 min，冷却，加甲醇至刻度，摇匀，即得地榆皂苷元对照品储备液。

2.3.3 供试品溶液的制备精密称取地榆总皂苷水解产物粉末0.01 g，置于25 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超声30 min，冷却，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45

μm微孔滤膜，备用。

2.3.4 专属性考察

分别配制阴性对照溶液（空白溶剂）、对照品溶液、供试品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件进行试验，结果见图 1。在该分析条件，地榆皂苷元色谱峰理论塔板数大于5 000，与其他组分的色谱峰分离良好，且无阴性干扰。结果表明，本方法具有较好的专属性。

2.3.5 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10μL注入高效液相色谱仪中，测定，以对照品进样量为横坐标（X），以峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，经线性回归，回归方程为Y=742.55 X-9.637 3，r=1.000 0，对照品地榆皂苷元进样量在51.2～512.0μg/mL线性关系良好。

2.4 地榆总皂苷酸水解单因素考察

取同一批地榆总皂苷，均按照“2.1”项下进行处理，以地榆皂苷元的产量为评价指标，按照“2.2”和“2.3”项下方法测定地榆皂苷元的转化率与地榆皂苷元的产量。

2.4.1 盐酸浓度对地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量的影响

分别称取0.2 g地榆总皂苷，共5份，分别加入浓度为1、2、3、4、5 mol/L的盐酸20 mL，90℃水解2 h，放冷至室温，加入等量的氯仿萃取2次，挥干，水解产物经HPLC检测，计算地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量及地榆皂苷元转化率。表 1反映了不同浓度的盐酸对地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量的影响，可以看出，不同浓度的盐酸对地榆总皂苷水解效果的影响很明显，各浓度盐酸水解地榆总皂苷获得地榆皂苷元产量是有差异的，当盐酸的浓度为1、3、5 mol/L时所水解得到的地榆皂苷元的产量较低；当盐酸的浓度为2、4 mol/L时所水解得到的地榆皂苷元的产量升高。当盐酸浓度为4 mol/L时地榆皂苷元达到最高值，说明地榆皂苷元在一定的酸度下才能得到较彻底的水解。

2.4.2 料液比对地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量的影响

分别称取0.2 g地榆总皂苷，共5份，分别加入浓度为4 mol/L的盐酸10、20、30、40、50 mL，在90℃水解2 h，放冷至室温，加入等量的氯仿萃取2次，挥干，水解产物经HPLC检测，计算地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量及地榆皂苷元转化率。表 2反映了不同料液比对地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量的影响，地榆总皂苷酸水解为皂苷元并不是料液比越大，水解程度越高。当料液比为1：200时，地榆总皂苷酸水解为地榆皂苷元的程度最大；当料液比继续增大时，地榆总皂苷酸水解为地榆皂苷元的产量反而下降。这可能是当料液比超过一定值时，淀粉、蛋白质等其他杂质大量浸出并变性沉淀包裹了部分皂苷，当料液比为1：200时地榆皂苷元达到最高值，因此，料液比以1：200左右为宜。

2.4.3 水解时间对地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量的影响

分别称取0.2 g地榆总皂苷共5份，加入40 mL 4 mol/L的盐酸，在90℃分别水解1、2、3、4、5 h，放冷至室温，加入等量的氯仿萃取2次，挥干，水解产物经HPLC检测，计算地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量及地榆皂苷元转化率。表 3反映了不同水解时间对地榆总皂苷水解的影响，可以看出，当水解时间从1 h增加到5 h，地榆皂苷元的产量呈下降趋势；其原因可能是水解初期时水解基本完全，随着水解时间的增加，可能存在副反应的进行，导致地榆皂苷元的生成逐渐减少。

2.4.4 水解温度对地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量的影响

分别称取0.2 g地榆总皂苷，共5份，加入40 mL 4 mol/L的盐酸，分别在75、80、85、90、95℃水解1 h，放冷至室温，加入等量的氯仿萃取2次，挥干，水解产物经HPLC检测，计算地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量及地榆皂苷元转化率。表 4反映了不同温度对地榆总皂苷水解产物中地榆皂苷元产量的影响，可以看出，水解温度90℃时，地榆皂苷元的得率明显高于85℃和95℃的。由于温度过低，地榆皂苷水解较慢，同时有些地榆皂苷未发生水解；温度过高，可能杂质过多浸出而抑制皂苷浸出水解或部分苷元发生转化，生成的不是真正的皂苷类物质。因此，水解温度以90℃左右为宜。

2.5 地榆总皂苷酸水解的正交试验

根据单因素得出的最佳提取条件范围，设计4因素3水平正交试验，并进行极差分析和方差分析。

根据单因素实验考察结果以及重复单因素实验验证，以地榆皂苷元质量分数（地榆皂苷元质量分数=水解产物中地榆皂苷元质量/水解产物的质量）为考察指标，设计以盐酸浓度（稀盐酸，A）、料液比（B）、水解温度（C）、水解时间（D）4个因素3水平的L₉(3⁴)正交试验，优化地榆总皂苷酸水解工艺参数。精密称取地榆总皂苷0.2 g，平行9份，置圆底烧瓶中，按L₉(3⁴)正交表分别进行试验，试验设计及结果见表 5。不考虑交互作用，进行方差分析，结果见表 6。

根据正交试验结果分析可知各因素对工艺影响顺序为A＞D＞B＞C，最优提取工艺为A₂B₂C₃D₁，各因素对实验结果无显著影响。综合实际成本考虑，确定工艺为A₂B₂C₃D₁：加200倍量4 mol/L盐酸溶液，92℃下水浴0.5 h。

2.6 验证试验

选取3批地榆饮片，均按照“2.1”项下进行处理，分别称取1 kg地榆饮片，按照最优工艺进行验证，分别按照“2.2”和“2.3”项方法测定地榆皂苷元的转化率及地榆皂苷元质量分数，地榆皂苷元转化率分别为65.38%、64.78%、64.92%，RSD为0.48%，地榆皂苷元质量分数分别为61.73%、62.12%、62.51%，RSD为0.63%。验证结果说明优选的工艺条件稳定可行。

3 讨论

地榆总皂苷是一类活性很好的化合物，具有广泛的生理活性。这些化合物都是通过运用传统经典的植化手段和现代色谱技术获得，其单体皂苷的制备过程通常经过提取、萃取、柱色谱等步骤，整个过程显得比较漫长、繁琐。目前，有关地榆总皂苷及其单体皂苷的研究多集中于提取纯化工艺和定量测定方面，水解作为一种获得地榆皂苷单体的手段对其研究还比较少。

地榆皂苷的升高白细胞作用^[18-20]已经得到证实，而地榆皂苷的结构与这些活性单体皂苷相似。因此，利用其皂苷元进行一定程度上的结构修饰，有望筛选出活性更强、有潜在开发价值的衍生物。

地榆总皂苷中以地榆皂苷-Ⅰ与地榆皂苷-Ⅱ为主，地榆总皂苷中以地榆皂苷-Ⅰ为主要组分，地榆总皂苷氢氧化钠水解后以地榆皂苷-Ⅱ为主要组分，地榆皂苷-Ⅰ与地榆皂苷-Ⅱ在结构式上的唯一区别—地榆皂苷-Ⅰ比地榆皂苷-Ⅱ28位上多了1个葡萄糖，而地榆皂苷-Ⅰ与地榆皂苷-Ⅱ的皂苷元均为同一成分。本课题前期的药理实验证明地榆总皂苷对CTX所致小鼠骨髓抑制有显著的保护作用，若能够通过简单的水解工艺得到地榆皂苷元，有望修饰获得一系列衍生物，为能从中筛选出有开发潜力的化合物打下基础。

本实验在充分积累本课题组前期大量有关地榆皂苷及其水解研究的基础上，首次对地榆总皂苷酸水解产物地榆皂苷元的水解工艺进行了研究，运用单因素考察和正交设计试验得出了地榆皂苷元的最佳水解工艺：料液比1：200，盐酸浓度为4 mol/L，水解时间0.5 h，水解温度92℃。通过验证实验证明，此条件下地榆皂苷元的质量分数可达62.12%，非常适合工业化生产。