2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.13.016 |
2. 陕西中医药大学 陕西省秦岭中草药应用开发工程技术研究中心, 陕西 西安 712046
2. Shaanxi Qinling Application Development and Engineering Center of Chinese Herbal Medicine, College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xi'an 712046, China
半夏来源于天南星科植物半夏Pinellia ternate (Thunb.) Berit. 的干燥块茎，具有燥湿化痰、消痞散结的功效[1]。因其有小毒，炮制后方能入药，临床上常用的炮制品有清半夏、姜半夏、法半夏、京半夏等。半夏成分复杂，主要含生物碱、有机酸、核苷类、蛋白质、多糖、挥发油等，其中与药效相关的成分主要有生物碱、有机酸、核苷类[2-4]。现代药理研究表明，有机酸具有止咳作用，其作用机制主要是能够抑制咳嗽中枢，降低呼吸道感受器敏感性[5-7]。
指纹图谱技术是中药研究的一个热点，它既能较全面地反映中药中化学成分的种类与数量，又能从整体上评价中药质量，是一种可行的质量控制方法[8]。中药指纹图谱所反映的化学成分是否与药效物质基础一致，与药效相关，这些问题尚不明确。因此，本实验通过HPLC法建立了半夏及其炮制品总有机酸指纹图谱，以浓氨水刺激小鼠黏膜引咳为模型进行了药效学研究，采用灰色关联度分析法对半夏炮制前后总有机酸指纹图谱与止咳作用之间的相关性进行分析，建立谱-效关系，阐明半夏及其炮制品止咳作用的物质基础，为其质量控制与评价提供理论依据。
1 材料 1.1 仪器Agilent technologies 1200高效液相色谱仪；BP121S十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ-500DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Allegra X-22R离心机（美国贝克曼公司）；Heidolph-Laborota 4000旋转蒸发仪（德国海道夫公司）。
1.2 试剂琥珀酸（中国食品药品检定研究院，批号896-200001，质量分数99.6%）；磷酸可待因（青海制药厂有限公司，批号20100110）；氨水（成都市科龙化工试剂厂，批号20110617）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，成都市科龙化工试剂厂，批号20100302）；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
1.3 药材半夏采自全国5个省份，共10批；半夏炮制品各8批，5批购自于药厂，3批为自制炮制品，共计32批。样品经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定为天南星科植物半夏Pinellia ternate (Thunb.) Berit. 的干燥块茎及其炮制品清半夏、姜半夏、法半夏和京半夏。样品来源信息见表 1。
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表 1 样品来源 Table 1 Origins of samples |
1.4 实验动物
昆明种小鼠，雌雄各半，体质量（20±2）g，由成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号SOXK（111）2008-24。
2 方法与结果 2.1 半夏的炮制自制清半夏、姜半夏、法半夏按照《中国药典》2010年版的炮制方法进行炮制[9]，京半夏炮制方法参考文献报道[10]。
2.2 半夏及其炮制品总有机酸的提取制备取各批半夏及半夏炮制品适量，粉碎，过4号筛，加入10倍量75%乙醇，加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩成浸膏，加5%无水碳酸钠溶液调pH值至12；然后用醋酸乙酯反复萃取至萃取液无色，收集碱水液，以盐酸酸化至pH值为2；再用醋酸乙酯反复萃取，至无有机酸反应（0.1%溴酚蓝乙醇溶液作为薄层色谱显色剂，喷洒后呈黄色斑点），合并醋酸乙酯萃取液，回收溶剂，蒸干后溶解，滤过，滤液浓缩至干，得总有机酸提取物。
2.3 半夏及其炮制品总有机酸的止咳作用研究 2.3.1 受试药物配制将各批半夏及半夏炮制品总有机酸提取物，按实验动物（小鼠）与成人服用剂量计算公式进行换算，称取各提取物，加含2滴1%聚山梨酯-80的0.5% CMC-Na制成混悬液，给药体积0.01 mL/g。
2.3.2 浓氨水引咳实验采用浓氨水引咳实验分别对10批半夏及32批炮制品的总有机酸提取物进行药效学评价。实验按照半夏、清半夏、姜半夏、法半夏和京半夏分5批进行，每批随行设置对照组和阳性药物组。每1个样品均设高、低剂量（以各样品提取物中总有机酸的量设置总有机酸0.06、0.12g/kg 2个剂量，换算成各样品的生药剂量）组，每个剂量组均为10只小鼠，雌雄各半。昆明种小鼠适应3 d，实验前小鼠禁食不禁水12 h。对照组ig含2滴1%聚山梨酯-80的0.5% CMC-Na，阳性药物组ig磷酸可待因30 mg/kg，给药组分别ig给予各批次药材制得的总有机酸提取物，每天1次，连续7 d。末次给药1 h后，分别将小鼠按照分组顺序放置于倒置的500 mL容器中，内放一棉球，用1 mL注射器吸取25%氨水0.3 mL注入棉球上，迅速倒置容器（以防气体泄漏），秒表记录时间，观察记录小鼠的咳嗽潜伏期（从记录时间起到小鼠第1次咳嗽的时间）、3 min内咳嗽次数（以小鼠腹肌收缩，张大口同时并伴有咳嗽声为准），计算抑咳率。
抑咳率＝(给药前小鼠的咳嗽次数－给药后小鼠的咳嗽次数)/给药前小鼠的咳嗽次数
结果表明同种半夏或半夏炮制品不同批次间观察的药效指标数据差异不大，故将同一种样品的不同批次的药效指标进行合并，求算平均值，比较半夏及不同半夏炮制品不同剂量下的药效。数据均以x±s表示，采用SPSS18.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析。结果见表 2。与对照组比较，磷酸可待因组、半夏及半夏炮制品总有机酸各组均能延长小鼠咳嗽潜伏期，减少小鼠3 min内咳嗽次数（P＜0.05、0.01）；半夏及半夏炮制品总有机酸高剂量组的止咳作用均强于低剂量组，其中京半夏作用最强，抑咳率为63.51%。
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表 2 半夏及半夏炮制品总有机酸止咳作用比较 ( x±s) Table 2 Results of antitussive effect of total organic acids in crude and processed Pinelliae Rhizoma ( x±s) |
2.4 半夏及其炮制品总有机酸HPLC指纹图谱研究[11] 2.4.1 色谱条件
Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以10% Na2HPO4-HAc缓冲液（pH 2.7）-乙腈为流动相进行梯度洗脱，程序见表 3；检测波长256 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL。
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表 3 流动相梯度洗脱程序 Table 3 Elution program of gradient |
2.4.2 对照品溶液的制备
精密称取琥珀酸对照品适量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解，定容，摇匀，配成0.2 mg/mL的对照品溶液。
2.4.3 供试品溶液的制备精密称取半夏及半夏炮制品各批总有机酸提取物0.1 g，加甲醇溶解并定容于10 mL量瓶，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.4.4 半夏及半夏炮制品总有机酸指纹图谱的建立精密吸取各供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，进行测定，记录色谱图。半夏及半夏炮制品各批样品色谱图经过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”处理得到药材对照指纹图谱。对照品溶液见图 1-A，半夏及各半夏炮制品对照指纹图谱见图 1-B，各共有峰的峰面积见表 4。
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表 4 半夏及其炮制品总有机酸HPLC 各共有峰的峰面积 Table 4 HPLC peak areas of common peaks of total organic acids in crude and processed Pinelliae Rhizoma |
由图 1可知，半夏及其炮制品清半夏、姜半夏、法半夏和京半夏总有机酸指纹图谱的共有峰分别为13、14、16、16、18个，其中6号峰为琥珀酸。
2.5 半夏及其炮制品总有机酸止咳作用的谱-效关系研究采用灰色关联度分析方法，分别以止咳评价指标咳嗽潜伏期、3 min内咳嗽次数及抑咳率为母序列，半夏及其炮制品清半夏、姜半夏、法半夏和京半夏总有机酸指纹图谱的各共有峰峰面积为子序列，将原始数据设为参考数据序列X0(k)＝{X0(1),X0(2)，…，X0(n)}；m个比较数据系列：Xi(k)＝{Xi(1)，Xi(2)，…，X0(n)}，其中i＝1，2，…，m；X0表示各共有峰峰面积；X0(k)中的k表示各共有峰编号1～n；Xi表示各剂量组止咳药效；Xi(k)中的k表示各剂量组的编号1～n；m＝2。
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图 1 琥珀酸对照品色谱图 (A) 和半夏及其炮制品总有机酸对照指纹图谱 (B) Fig.1 HPLC of succinic acid (A) and HPLC fingerprints of total organic acids in crude and processed PinelliaeRhizoma (B) |
按公式计算共有峰与止咳作用之间的相对关联度（γ0i）、绝对关联度（ε0i）以及综合关联度（ρ0i），评价二者的相关性，确定各色谱峰对药效贡献的大小，结果见表 5。
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表 5 半夏及半夏炮制品总有机酸HPLC 各共有峰峰面积与止咳作用关联度分析结果 Table 5 Grey correlation degree analysis for peak areas of HPLC common peaks and anti-tussive effect of total organic acids in crude and processed Pinelliae Rhizoma |
ε0i计算过程如下：
| $\begin{align} & \left| {{s}_{0}} \right|=\left| \sum\nolimits_{k=2}^{n-1}{x_{0}^{0}(k)+\frac{1}{2}x_{0}^{0}(n)} \right|,\left| {{s}_{i}} \right|=\left| \sum\nolimits_{k=2}^{n-1}{x_{i}^{0}(k)+\frac{1}{2}x_{i}^{0}(n)} \right| \\ & \left| {{s}_{i}}-{{s}_{0}} \right|=\left| \sum\limits_{k=2}^{n-1}{(}x_{i}^{0}(k)-x_{0}^{0}(k)+\frac{1}{2}x_{i}^{0}(n)-x_{0}^{0}(n) \right| \\ & {{\varepsilon }_{0i}}=\frac{1+\left| {{s}_{0}} \right|+\left| {{s}_{i}} \right|}{1+\left| {{s}_{0}} \right|+\left| {{s}_{i}} \right|+\left| {{s}_{i}}-{{s}_{0}} \right|} \\ \end{align}$ |
γ0i计算过程如下：
| $\begin{align} & \left| s_{0}^{'} \right|=\left| \sum\nolimits_{k=2}^{n-1}{x_{0}^{0'}(k)+\frac{1}{2}x_{0}^{0'}(n)} \right|,\left| s_{_{i}}^{'} \right|=\left| \sum\nolimits_{k=2}^{n-1}{x_{i}^{0'}(k)+\frac{1}{2}x_{i}^{0'}(n)} \right| \\ & \left| s_{_{i}}^{'}-s_{0}^{'} \right|=\left| \sum\nolimits_{k=2}^{n-1}{x_{i}^{0'}(k)-x_{0}^{0'}(k)+\frac{1}{2}x_{i}^{0'}(n)-x_{0}^{0'}(n)} \right| \\ & {{\gamma }_{0i}}=\frac{1+\left| s_{_{0}}^{'} \right|+\left| s_{_{i}}^{'} \right|}{1+\left| s_{_{0}}^{'} \right|+\left| s_{_{i}}^{'} \right|+\left| s_{_{i}}^{'}-s_{_{0}}^{'} \right|} \\ \end{align}$ |
其中si′表示序列差xi0′(k)的残差值；x00′、xi0′分别表示各共有峰峰面积和各剂量组止咳药效归一化后的值；其余符号意义同上
ρ0i计算过程如下：
| ${{\rho }_{0i}}={{\theta }_{{{\varepsilon }_{0i}}}}+(1-\theta ){{\gamma }_{0i}},\theta \in \left[ 0,1 \right]$ |
由表 5可知，各共有峰与止咳作用的关联度存在较大差异。以止咳评价指标咳嗽潜伏期为母序列，各共有峰峰面积与止咳作用之间的ε0i大小排列顺序为9＞6＞12＞10＞4＞2＞8＞7＞20＞5＞16＞19＞14＞15＞13＞3＞1＞17＞11＞18，γ0i大于0.8的色谱峰有2、4、5、6、12号峰，ρ0i大于0.8的色谱峰有4、6、12号峰。
以止咳评价指标3 min内咳嗽次数为母序列，各共有峰峰面积与止咳作用之间的ε0i度大小排列顺序为13＞6＞9＞12＞10＞4＞2＞8＞7＞20＞5＞16＞19＞14＞15＞3＞1＞17＞11＞18，γ0i大于0.9的色谱峰有4、6、12号峰，ρ0i大于0.7的色谱峰有4、6、12、13号峰。
以止咳评价指标抑咳率为母序列，各共有峰峰面积与止咳作用之间的关联度大小排列顺序同3 min内咳嗽次数。
综合3个评价指标咳嗽潜伏期、3 min内咳嗽次数及抑咳率与各共有峰峰面积关联度的分析，结果表明4、6、12号色谱峰所代表的化学成分与止咳作用具有较强的相关性，对止咳作用贡献较大，其中6号色谱峰为琥珀酸。
3 讨论 3.1 色谱条件的考察半夏成分复杂，若使用单一的流动相较难得到理想的指纹图谱，在HPLC测定过程中，常选用多种溶剂进行梯度洗脱。本实验分别对10% NaH2PO4- HAc缓冲液（pH 2.5）-乙腈、10% Na2HPO4-HAc缓冲液（pH 2.5）-乙腈、10% KH2PO4-HAc缓冲液（pH 2.5）-乙腈、10% K2HPO4-HAc缓冲液（pH2.5）-乙腈及10%Na2HPO4-HAc缓冲液（pH 2.7）-乙腈5种流动相进行了考察，结果表明以10% Na2HPO4-HAc缓冲液（pH 2.7）-乙腈为流动相的梯度洗脱，得到的色谱峰较多且分离效果较好；通过比较不同波长下的HPLC指纹图谱，发现在265 nm下色谱峰数目多，且分离度好。
3.2 药理活性部位的筛选本实验前期对半夏及半夏炮制品95%乙醇、总有机酸、总生物碱3种提取物进行了止咳作用的比较，通过药理实验筛选出总有机酸提取物能够延长小鼠咳嗽潜伏期，减少小鼠3 min内咳嗽次数，增强止咳抑制率，具有较强的止咳作用，与文献报道一致[5]。
3.3 谱-效关系研究目前，研究谱-效关系的方法主要有灰色关联度分析、回归分析、聚类分析、相关分析等方法[12]。灰色关联度分析法是一种多因素统计分析方法，根据各因素的样本数据通过灰色关联度描述因素间关系的大小、强弱及次序，若样本数据反映出两因素变化趋势基本一致，则二者间关联度较大，反之，关联度较小。灰色关联度分析法包括灰色绝对关联度、灰色相对关联度和灰色综合关联度，在前者的基础上拓展出后两者。绝对关联度是从绝对量的关系着眼考虑；相对关联度是从各时刻观测数据相对始点的变化率着眼考虑；灰色综合关联度克服了关联度的绝对性和相对性，得到更接近现实问题的结论，大量实例表明，灰色相对关联度和综合关联度已在科学研究和现代化工过程优化中得到广泛应用，特别是阐明中药的谱-效关系[13]。因此，本实验采用灰色关联度分析法，对半夏及其炮制品总有机酸HPLC指纹图谱的各共有峰峰面积与止咳的3个评价指标（咳嗽潜伏期、3 min内咳嗽次数及抑咳率）进行相关性分析，首次建立了半夏及其炮制品总有机酸止咳作用的谱-效关系。半夏及其炮制品总有机酸HPLC指纹图谱中，4、6、12号色谱峰所代表的化学成分与止咳作用具有较强的关联度，对止咳作用贡献较大，其中6号色谱峰为琥珀酸，与文献报道的琥珀酸具有止咳、平喘的作用相一致[14-15]，进一步证实了琥珀酸的止咳作用。
此外，通过谱-效关系分析，发现4号色谱峰，峰面积大、关联度强，可作为除琥珀酸外另一个评价半夏及其炮制品质量的新指标，但其反映的化学成分还需进一步研究。
综上所述，本实验建立的总有机酸止咳作用的谱-效关系，可阐明半夏及其炮制品止咳作用的物质基础，同时为其质量控制与评价提供了一定的理论依据。
| [1] | 白权, 李敏, 贾敏如, 等. 四川南充半夏祛痰镇咳作用研究[J]. 中国实验方剂学杂志 , 2004, 10 (3) :50–52. |
| [2] | 周倩, 吴皓, 许风清, 等. 半夏中生物碱的研究[J]. 中国中医药信息杂志 , 2006, 1 (13) :102–103. |
| [3] | Luo Q Y, Xiao Y W, Wang K C, et al. Analysis on the genetic control of heterosis for guanosine and organic acid contents in tuber of Pinellia ternata by using of random amplified polymorphic DNA (RAPD) makers[J]. J Med Plants Res , 2013, 7 (14) :857–862. |
| [4] | 周欣, 汤洪波, 龚小见, 等. 半夏药材水溶性成分的HPLC指纹图谱研究[J]. 中华中医药杂志 , 2009, 24 (12) :1635–1637. |
| [5] | 张科卫, 吴皓, 沈绣红, 等. 半夏中总游离有机酸的作用研究[J]. 南京中医药大学学报 , 2001, 17 (3) :159–161. |
| [6] | Yu P, Cheng S, Xiang J, et al. Expectorant, antitussive, anti-inflammatory activities and compositional analysis of Aster tataricus[J]. J Ethnopharmacol , 2015, 164 :328–333. |
| [7] | Li Z Y, Zhi H J, Zhang F S, et al. Metabolomic profiling of the antitussive and expectorant plant Tussilago farfara L. by nuclear magnetic resonance spectroscopy and multivariate data analysis[J]. J Pharm Biomed Anal , 2013, 75 (5) :158–164. |
| [8] | 秦昆明, 郑礼娟, 沈保家, 等. 谱效关系在中药研究中的应用及相关思考[J]. 中国中药杂志 , 2013, 38 (1) :26–31. |
| [9] | 中国药典 [S]. 一部. 2010. |
| [10] | 王贵英. 京半夏的传统炮制法[J]. 湖南中医药导报 , 2002, 8 (1) :40–41. |
| [11] | 杨冰月. 基于物质基础和生物活性对半夏及其炮制品功效的相关性研究 [D]. 四川: 成都中医药大学, 2014. |
| [12] | 陈峰. 医用多元统计分析方法[M]. 北京: 中国统计出版社, 2006 . |
| [13] | 周长芹, 许宏伟, 何霞. 灰色绝对关联度模型的改进[J]. 郑州师范教育 , 2014, 3 (4) :25–27. |
| [14] | 金园, 岳旺. 琥珀酸的药理研究进展[J]. 药学通报 , 1983, 18 (2) :36–38. |
| [15] | 利红宇, 李钟, 黄艳玲, 等. 不同炮制的广地龙平喘化痰止咳药效比较[J]. 时珍国医国药 , 2010, 21 (6) :1464–1465. |