2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.12.017 |
大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（EG）属蒽醌苷类化合物，已从巴天酸模[1]、藏边大黄[2]、何首乌[3]、番泻叶[4]、板蓝根[5]、夜交藤[6]、虎杖[7-8]等植物中分离鉴定。现代药理学研究表明，EG具有抗炎[9]、抗菌、抗病毒[10]、改善睡眠[6]、提高智力[11]、神经保护和雌激素样作用[12-13]等生物活性。本课题组前期研究发现EG潜在抑制尿酸生成的关键酶黄嘌呤氧化酶活性，已申请中国发明专利[14]。目前商品化的EG对照品难以获得，《中国药典》2015年版对大黄、虎杖、何首乌等药材定量测定项下仍采用水解后测定苷元大黄素的方法。因此有必要建立一种高效制备EG的方法，为含有该成分的天然产物及其制剂的质量评价提供物质基础。
高速逆流色谱（HSCCC）是一种无固相载体的连续液-液分配色谱技术，目前广泛用于天然活性成分的分离制备[15-18]。不但分离效率高而且制备量大，同时消除了传统色谱技术固态载体导致的样品不可逆吸附、对样品的污染、变性、失活等影响[19]。本研究采用大孔树脂柱和ODS柱色谱分离虎杖提取物中的目标组分，HSCCC纯化制备了符合定量测定用的EG。
1 仪器与材料TBE-300C型高速逆流色谱仪，上海同田生化技术有限公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪配备G1311C四元输液泵，G1314F紫外检测器，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，Chemstation色谱工作站，美国安捷伦公司；LC-20AT输液泵，SPD- M20A二极管阵列检测器，LC solution色谱工作站，日本岛津制作所；Bruker AV-500核磁共振波谱仪；Micro TOFQ飞行时间质谱仪，德国布鲁克光谱仪器公司；BT 125D分析天平，德国赛多利斯公司。分析型色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18、Extend-C18、Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），美国安捷伦公司。
HPD100大孔吸附树脂，沧州宝恩吸附材料科技有限公司；十八烷基键合硅胶（S-50 μm），日本YMC科学株式会社；氘代DMSO，日本和光纯药工业株式会社；色谱纯乙腈，美国天地有限公司；水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
虎杖药材购于安徽亳州市永刚饮片有限公司，批号121221，经大连大学冯宝民教授鉴定为蓼科虎杖属植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. 的干燥根茎和根，标本存放于青岛大学药学院，样品编号：QY-2012-PC-01。
2 方法与结果 2.1 HPLC分析条件色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～20 min，15%～20%乙腈；20～35 min，20%～30%乙腈；35～55 min，30%～50%乙腈；55～80 min，50%～60%乙腈；80～85 min，60%～100%乙腈；85～90 min，100%乙腈；检测波长为280 nm，体积流量为1.0 mL/min，进样量10 μL。
2.2 虎杖药材的提取[20]取虎杖药材1 kg，加入6倍量80%乙醇回流提取2次，每次2 h，提取液合并，减压回收乙醇得乙醇提取物282 g，HPLC图见图 1-A，峰面积归一化法计算乙醇提取物中EG质量分数为37.77%。
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图 1 虎杖乙醇提取物(A)和50%乙醇洗脱部位(B)HPLC图 Fig.1 HPLC of ethanol extract (A) and 50% ethanol eluted part (B) of PCRR |
2.3 柱色谱分离
取虎杖乙醇提取物280 g加水溶解，经HPD100大孔树脂柱色谱（柱径10 cm，填充高度40 cm）依次用水和30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，再用50%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收乙醇得50%乙醇洗脱部位76 g，HPLC图见图 1-B，峰面积归一化法计算50%乙醇洗脱部位中EG质量分数为61.47%。取50%乙醇洗脱部位50 g，经ODS柱色谱（柱径5 cm，填充高度30 cm），以甲醇-水（5：5）洗脱，每50 mL为1馏份，经TLC检识合并69～82号馏份，获得目标组分7.65 g，HPLC图见图 2，峰面积归一化法计算目标组分中EG质量分数为75.82%。
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图 2 目标组分HPLC图 Fig.2 HPLC of target fraction |
2.4 HSCCC溶剂系统的选择
采用HPLC法测定目标组分中各色谱峰在不同组成和比例溶剂系统中的分配系数（K），取目标组分5 mg，加入预先达到分配平衡的2相溶剂各2 mL使溶解，剧烈振摇使充分混合，待达到2相分配平衡后，分别精确取上相和下相溶液各1 mL，蒸干，加甲醇2 mL使溶解，HPLC分析，各色谱峰在上相溶液中的峰面积值记作A1，在下相溶液中的峰面积值记作A2，计算在不同溶剂系统中的K（K=A1/A2，其中K1、K2、K3、K4分别代表EG和2～4号杂质组分的分配系数）。不同溶剂系统的K值和相邻色谱峰之间的分离度见表 1，溶剂系统2对EG色谱峰与相邻色谱峰的分离度为2.14，满足基线分离要求，且与溶剂系统3和4比较，EG色谱峰K值最小，出峰时间短，节省分离时间，故选择二氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水（8：1：6：5）作为溶剂系统进行制备分离。
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表 1 不同溶剂系统的K值和分离度 Table 1 K values and resolution of different solvent systems |
2.5 HSCCC分离制备
按二氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水（8：1：6：5）配制溶剂体系，充分混匀后静置分层，平衡后分出两相，超声脱气30 min。上相作固定相，下相作流动相。开启恒温水浴循环器设置温度为25 ℃，将上相以40 mL/min的体积流量泵入分离管内，当固定相充满整个管道后，开启主机，调节主机转速为850 r/min，待转速稳定后以5 mL/min的体积流量泵入下相，有下相流出时体系平衡。取目标组分100 mg，加上相和下相各10 mL使溶解（质量浓度5 mg/mL），进样。紫外检测波长为280 nm，手动收集107～128 min流出液（图 3），减压干燥得黄色粉末32 mg。
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图 3 目标组分HSCCC色谱图 Fig.3 HSCCC of target fraction |
2.6 结构鉴定
黄色粉末（甲醇），mp 237～238 ℃，ESI-MS m/z: 431 [M－H]−。1H-NMR (DMSO-d6,500 MHz) δ: 13.22 (1H,s,1-OH),7.43 (1H,brs,H-4),7.26 (1H,brs,H-5),7.13 (1H,br s,H-2),6.99 (1H,brs,H-7),5.04 (1H,d,J = 7.5 Hz,H-1′),3.73 (1H,brd,J = 11.4 Hz,H-6′a),3.54 (1H,dd,J = 11.6,5.0 Hz,H-6′b),3.23～3.46 (4H,m,H-2′～5′),2.39 (3H,s,-CH3)；13C-NMR (DMSO-d6,125 MHz) δ: 186.2 (C-9),182.2 (C-10),165.1 (C-6),161.7 (C-8),161.2 (C-1),146.7 (C-3),136.4 (C-10a),132.1 (C-4a),124.1 (C-2),119.1 (C-4),114.5 (C-8a),112.8 (C-9a),108.8 (C-5),108.6 (C-7),101.0 (C-1′),77.3 (C-3′),76.3 (C-5′),73.3 (C-2′),69.4 (C-4′),60.6 (C-6′),21.3 (-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定该化合物为EG。
2.7 不加校正因子的主成分自身对照法的纯度测定[22-23] 2.7.1 供试品溶液的制备精密称取制得的EG适量，加甲醇制成1.10 mg/mL的溶液。
2.7.2 自身对照溶液的制备精密吸取供试品溶液0.5 mL，置25 mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.7.3 色谱条件色谱柱为Zorbax SB-C18，柱温为25 ℃，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱条件为0～20 min，15%～30%乙腈；20～80 min，30%乙腈；检测波长为280 nm，体积流量为1.0 mL/min，进样量10 μL。
2.7.4 测定方法与结果精密吸取自身对照溶液10 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，计算主色谱峰峰面积的RSD为0.90%。分别精密吸取供试品溶液和自身对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录主色谱峰保留时间2倍以上的色谱图（图 4），测定供试品溶液各杂质峰面积和自身对照溶液主色谱峰面积，以各杂质峰面积之和与主色谱峰面积比值计算杂质的量。结果表明，EG质量分数为99.94%（n=3）。
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图 4 纯度检查的HPLC图 Fig.4 HPLC of purity test |
3 讨论
基于前期研究发现虎杖药材中EG的量较高，因此选择虎杖作为研究对象制备EG对照品。虎杖中含有蒽醌类、黄酮类和茋类等多种不同结构类型的化合物，为提高目标对照品的纯度，构建了大孔吸附树脂和ODS柱色谱分离目标组分策略，经大孔吸附树脂柱色谱不同体积分数乙醇洗脱，EG主要集中在50%乙醇洗脱部位，用水和30%乙醇洗脱去除了提取物中大极性化合物，使EG得到富集。50%乙醇洗脱部位经操作方便周期短的ODS柱色谱进一步分离得到仅含4个主色谱峰的分离组分。
溶剂系统的选择是HSCCC分离中的关键环节，通常通过测定待分离样品中各色谱峰在溶剂系统中的K值和相邻色谱峰的分离度来判断溶剂系统是否适合目标组分的分离。对于HSCCC分离，待分离样品中各色谱峰在2相溶剂系统中的K值范围为0.2～5[24-25]，理想的相邻色谱峰的分离度应该大于1.5（α=K2/K1，K2＞K1）[25-26]。溶剂系统1待分离样品中各色谱峰的K值偏小，在固定相中保留时间短，难以分离；溶剂系统2～4待分离样品中各色谱峰的K值均符合K值范围，溶剂系统2的K值最小，EG色谱峰出峰时间短，节省分离时间；溶剂系统2～4的EG色谱峰与相邻色谱峰的分离度均满足基线分离要求。考虑分离时间和分离效果，选择二氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水（8：1：6：5）作为溶剂系统进行制备分离。
曾采用制备液相色谱分离但效果不太理想，柱色谱结合HSCCC分离得到的EG经HPLC-DAD分析为1个主色谱峰，改变流动相梯度洗脱条件和色谱柱测定均未出现异常峰，HPLC不加校正因子的主成分自身对照法测定纯度符合中药对照品的要求。
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