中草药  2016, Vol. 47 Issue (10): 1753-1761
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.10.021
李珊珊, 陈玲玲, 王鹤萌, 胡宝忠, 常缨 . 香鳞毛蕨4CL基因密码子使用特性及表达预测分析[J]. 中草药, 2016, 47(10): 1753-1761.
LI Shan-shan, CHEN Ling-ling, WANG He-meng, HU Bao-zhong, CHANG Ying . Analysis on codon using features and expression prediction of 4CL gene in Dryopteris fragrans[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2016, 47(10): 1753-1761 .
香鳞毛蕨4CL基因密码子使用特性及表达预测分析
李珊珊1,2, 陈玲玲1, 王鹤萌1, 胡宝忠1, 常缨1     
1. 东北农业大学生命科学学院, 黑龙江 哈尔滨 150030 ;
2. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161006
收稿日期: 2015-09-06
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31070291);齐齐哈尔市科学技术项目(NYGG-201206-4)
作者简介: 李珊珊(1983-),女,讲师,博士研究生,主要从事植物分子生物学研究。E-mail: lishanshan83@163.com
通信作者: 胡宝忠(1962-),男,教授,博士,主要从事植物分子生物学。E-mail:bzhu@neau.edu.cn
常缨(1970-),女,教授,博士,主要从事植物分子生物学。E-mail:changying@neau.edu.cn
摘要: 目的 研究蕨类植物中4CL基因的表达与分析,为蕨类植物次级代谢产物的积累和调控奠定理论基础。 方法 运用CHIPS、CUSP和CodonW在线程序对自主克隆的香鳞毛蕨4CL基因(Df4CL)序列进行分析,并与大肠杆菌、酵母菌、拟南芥、烟草等基因进行比较,对了解Df4CL基因密码子使用特性,为其选择合适的表达系统具有重要意义。 结果 Df4CL基因对ATGC选择没有偏向性,并且与小立碗藓的密码子使用偏好性相一致。在密码子使用频率上,Df4CL基因与拟南芥的差异小于与烟草、大肠杆菌、酵母的差异;基于4CL基因的密码子使用偏性的系统聚类分析表明,香鳞毛蕨与小立碗藓、拟南芥聚为一类。 结论 预示Df4CL基因更适合在拟南芥中外源表达。
关键词: 香鳞毛蕨     4-香豆酸辅酶A 连接酶     密码子使用特性     基因表达    
Analysis on codon using features and expression prediction of 4CL gene in Dryopteris fragrans
LI Shan-shan1,2, CHEN Ling-ling1, WANG He-meng1, HU Bao-zhong1, CHANG Ying1     
1. College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China ;
2. College of Life Sciences and Agriculture and Forestry, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China
Abstract: Objective Expression and analysis of 4CL gene of ferns, which lays the theoretical foundation for the accumulation and regulation of secondary metabolites of ferns. Methods Cloned 4CL gene (Df4CL) sequence from Dryopteris fragrans was analyzed by CHIPS, CUSP, and Codon W programs online, and then compared with Escherichia coli, yeast, Arabidopsis thaliana, and Nicotiana tabacum L. It is important to identify the codon usage of Df4CL gene and select appropriate expression systems. Results Df4CL gene had not the bias toward the synonymous codons with ATGC at the third codon position, but had the preference consistency with Physcomitrella patens codon usage. The differences in codon usage frequency between Df4CL gene and A. thaliana were less than those in N. tobacum, E. coli, and yeast. Based on 4CL gene codon usage bias of cluster analysis, it was shown that D. fragrans, P. patens, and A. thaliana were classed into one group. Conclusion The A. thaliana expression system may be more suitable for the exogenous expression of Df4CL gene of D. fragrans.
Key words: Dryopteris fragrans (L.) Schott     4-coumarate:CoA ligase (4CL)     codon using features     gene expression    

香鳞毛蕨Dryopteris fragrans(L.)Schott是鳞毛蕨科（Dryopteridaceae）鳞毛蕨属Dryopteris Adans多年生蕨类植物，其作为民间用药主要用于治疗关节炎及各种皮肤病，目前国内外研究学者发现，香鳞毛蕨具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、驱虫等作用[1-7]，由于其独特的药用价值而引起人们的广泛关注。近年来对香鳞毛蕨的研究主要集中在对其化学成分、功能及多样性的研究[8-10]，而鲜少有关于次级代谢产物相关基因的报道。4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL，EC 6.2.1.12）是苯丙氨酸代谢途径的关键酶，其途径产生的类黄酮、木质素等次生物质在植物抗逆境、抗病害上有非常重要的作用[11-13]。因此，深入研究4CL基因对次级代谢产物的积累具有至关重要的意义。

为深入研究4CL基因的功能及蛋白质的特性常常需要基因的外源表达，而基因的外源表达受到很多因素的影响，其中密码子偏好性是影响外源基因表达的重要因素之一。已知物种对密码子的使用不是随机的，往往倾向于使用一种或几种特定的同义密码子，即存在密码子使用偏好性（codon usage bias）[14]。密码子偏性的分析有助于揭示有关物种间或某一物种的基因家族间的基因进化规律；了解转录和翻译进程中的调控机制；在预测外源基因的最适宿主和通过改良外源基因以提高其表达水平等方面具有重要意义[15]。

本研究利用自主克隆的Df4CL基因序列，通过CHIPS、CUSP和CodonW在线程序在线程序分析Df4CL基因密码子使用偏好性，并且与大肠杆菌、酵母菌、拟南芥、烟草等基因组密码子偏好性进行比较，并进行聚类分析，以期为该基因实现异源表达选择合适的宿主表达系统，或者通过优化密码子提高基因的表达量，为深入了解该基因及表达调控机制提供理论基础，为进一步研究4CL蛋白质的结构和功能奠定基础。

1 材料和方法 1.1 序列数据

Df4CL基因为前期试验所得，并提交到美国国立生物技术信息中心NCBI，基因序列号分别为Df4CL1（KF801576）、Df4CL2（KF836752）、Df4CL3（KF836753）和Df4CL4（KF836754）。其他序列通过NCBI收集获得（表 1）。小立碗藓Physcomitrella pAtens Bruch、火炬松Pinus teada L.、拟南芥Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.、烟草Nicotiana tabacum Linn.、水稻Oryza sativa L.、黑麦草Lolium perenne L.的序列通过NCBI收集获得（表 1）。

表 1 4CL基因的完整cDNA和编码氨基酸序列 Table 1 Complete cDNA and coded amino acid sequences of 4CL gene

1.2 方法 1.2.1 4CL基因家族密码子使用性参数分析

利用CodonW软件分析Df4CL基因及拟南芥、烟草、水稻、黑麦草、火炬松、小立碗藓、江南卷柏等植物4CL基因家族密码子使用特性，参数包括：A3s、G3s、C3s、T3s（同义密码子在第3位上相应碱基的出现频率）、密码子适应指数（CAI）、密码子偏爱指数（CBI）、最优密码子使用频率（FOP）、密码子有效数（NC）、密码子第3位的（G＋C）量（GC3s）、基因的（G＋C）量（GC）、同义氨基酸数（L-xym）、氨基酸数（L-aa）、平均亲水性值（Gravy）和芳香性值（Aroma）等。

1.2.2 4CL基因家族同义密码子相对使用度（RSCU）分析

RSCU是某一特定的密码子在编码对应氨基酸的同义密码子中的相对概率。本研究应用MEGA 5.0软件计算各基因CDS序列的RSCU值。

1.2.3 Df4CL基因家族表达预测

密码子使用频率分别采用EMBOSS在线程序（http://vm-bioinfo.toul-ouse.inra.fr/emboss）中的CHIPS（codon heterozygosity in a protein coding sequence）和CUSP（create a codon usage table）进行分析。本实验所采用的大肠埃希菌、酵母、拟南芥、烟草基因组的密码子使用频率数据来源于Codon Usage Database（http://www.kazusa.or.jp/codon）。

1.2.4 Df4CL基因家族聚类分析

对植物中基因家族密码子使用偏好性的聚类采用SPSS 19系统多元分析软件。在此过程中，将每一条基因作为一个对象，密码子的RSCU值作为变量。去除值始终为1的编码Trp和Met的密码子UGG和AUG，再除去3个不编码氨基酸的终止密码子，取余下的59个密码子的值对基因的密码子使用偏好性进行聚类分析。

2 结果与分析 2.1 4CL基因家族密码子使用性参数分析

利用CodonW软件分析江南卷柏、小立碗藓、火炬松、拟南芥、烟草、大豆、水稻、黑麦草等植物中的4CL基因家族密码子使用情况（表 2）。在这些参数中，CAI、CBI和NC常用于预测基因表达水平[15]。一般CAI和CBI呈现正相关性，值在0～1，越接近1表示密码子偏好性越强，基因表达水平越高[16-17]，而与NC则呈现负相关，NC数值一般在20～61，越靠近20表示同义密码子偏性越大，越靠近61表示同义密码子偏性越小[18]。高表达基因其密码子偏爱程度大，CAI和CBI值偏大而NC值较小；低表达基因则含有较多种类的稀有密码子，故偏爱程度低，CAI、CBI值较小而NC值较大，其值会受到基因氨基酸组成和基因长短的影响[19-20]。从数据上看，黑麦草Lp4CL1、Lp4CL2和Lp4CL3，水稻Os4CL1，小立碗藓Sm4CL1的NC值在35左右，表达水平较高，而小立碗藓Pp4CL1-4，拟南芥At4CL2、At4CL4，大豆Gm4CL1、Gm4CL3-4，水稻Os4CL2的NC值在55以上，表达水平较低，剩下的4CL基因表达水平一般。一般认为GC量和GC3s这2个因素对基因的密码子选择有重要影响。在这9种植物28条基因序列中13条4CL基因GC量小于0.5，预示4CL基因对GC没有明显的偏好性。GC3s值大于0.5的占28%，说明大部分4CL基因偏好以A/T结尾的密码子。

表 2 不同植物中4CL基因家族密码子使用特性 Table 2 Codon using feature of 4CL gene in various plants

2.2 4CL基因家族RSCU分析

RSCU是一个氨基酸所对应的密码子实际运用个数与理论运用个数之间的比值，能直观地反映出密码子使用的偏好性程度[21]，与基因长度和氨基酸丰度无关。当实际运用个数与理论运用个数相同时，RSCU＝1，此时密码子不存在偏好性；当RSCU＞1时，则说明该密码子出现的频率比其他同义密码子高，为基因偏好使用的密码子；当RSCU＜1时，则密码子出现的相对频率较低，是基因较少使用的密码子。通过比较发现（表 3），在烟草中，RSCU＞1的密码子有29个，水稻中有28个，黑麦草中有25个，拟南芥中有31个，火炬松中有28个，江南卷柏中有28个，这些密码子即为这些植物的最常使用的密码子，即最优密码子。

表 3 香鳞毛蕨与其他植物中4CL基因家族RSCU Table 3 Relatively synonymous codon usage (RSCU) of 4CL gene in D. fragrans and other plants

2.3 Df4CL基因家族密码子使用分析

通过表 1可以看出，4CL基因在不同物种中一般以基因家族的形式出现，而本研究中前期获得的Df4CL基因，通过序列比对也确定为一个家族。利用CodonW软件分析Df4CL基因家族密码子使用情况（表 2），发现香鳞毛蕨Df4CL2-4的NC值在55以上，表达水平较低，而DF4CL1的CAI值最大，NC值相对较小，推测在无外界胁迫下，Df4CL基因家族内部更偏向于使用DF4CL1。Df4CL家族内部的GC量平均为0.495，GC3s平均量为0.500，说明香鳞毛蕨对ATGC选择没有偏向性。总体来看，香鳞毛蕨与小立碗藓的密码子使用情况基本一致。

通过对4CL基因家族RSCU分析（表 3），在香鳞毛蕨中，最优密码子RSCU＞1的密码子有29个，其中22个与拟南芥最优密码子使用情况相一致，20个与烟草最优密码子使用情况相一致，密码子相对使用度越一致越容易实现基因的外源表达。而其余密码子略有不同，例如Phe在香鳞毛蕨中密码子应用UUC，而拟南芥和烟草密码子使用UUU等。

2.4 Df4CL基因家族表达预测

鉴定基因的功能、蛋白特性及转基因经常需要基因的异源表达，而这个过程常常受到各种因素的限制，其中基因密码子与宿主密码子使用偏性的差异是影响表达的重要因素之一。如果外源基因含有大量与宿主表达系统差异较大的罕见密码子，特别是当罕见密码子成连续分布的时候，就会造成表达量极低或翻译提前终止。所以4CL基因在异源宿主内表达时必须要考虑密码子偏好性。基因密码子与宿主密码子使用频率的比值在0.5～2.0，表示二者的密码子偏好性较为接近，比值≤0.5或比值≥2.0，表示偏好性差异较大。本研究将Df4CL基因家族与大肠杆菌、酵母、拟南芥、烟草密码子使用频率进行比较。从表 4中不难发现，在Df4CL1基因与大肠杆菌、酵母、拟南芥和烟草的使用频率比值中，分别有20、21、16和17个；分析Df4CL2基因与大肠杆菌、酵母、拟南芥和烟草的使用频率比值中，分别有19、22、16和20个；在Df4CL3中与大肠杆菌、酵母、拟南芥和烟草的使用频率比值中，分别有18、18、14和20个，在Df4CL4中与大肠杆菌、酵母、拟南芥和烟草的使用频率比值中，分别有26、18、14和12个，说明Df4CL1、Df4CL2、Df4CL3基因更适合在拟南芥中外源表达；而Df4CL4基因更适合在拟南芥和烟草中表达。

表 4 香鳞毛蕨4CL基因与其他植物基因组的密码子出现频率(f) Table 4 Codon frequency and ratios of Df4CL gene in D. fragrans and various plants genome

2.5 香鳞毛蕨4CL基因家族聚类分析

为进一步了解所列物种4CL基因密码子使用差异的大小，根据表 3中基于密码子使用频率的聚类树状图（图 1）分析，可以看出，火炬松密码子使用频率与其他植物相比具有明显的差异性，而香鳞毛蕨与小立碗藓聚为一类，这表明亲缘关系较近的物种，密码子使用偏好性也比较相近，但它们与拟南芥也聚为一类，说明某些物种也存在一定的差异，但也进一步说明，香鳞毛蕨基因在拟南芥植物中表达是可行的。

图 1 基于4CL基因的RSCU的聚类树状图 Fig.1 Cluster dendrogram of RSCU values based on 4CL gene

3 讨论

苯丙烷代谢途径是植物三大代谢途径之一，可产生植物体中约有五分之一的次级代谢产物，而这些次级代谢产物不但对于植物本身具有不可替代的作用，而对于人们的健康也具有非凡的意义。黄酮类物质就是其中一个，为了更好地发挥药效，以期次级代谢产物更多的积累，而这条代谢途径中的关键基因将影响次级代谢产物的积累和调控。本研究中主要研究苯丙烷代谢途径中的关键调节酶4CL的基因，通过密码子使用特性预测其表达体系，为更好地表达蛋白提供重要的理论依据。

通过前期实验获得Df4CL基因4条，通过序列比对、保守区确定获得的4条4CL基因为一个基因家族。将Df4CL基因密码子使用频率与代表生物大肠杆菌、酵母和拟南芥、烟草基因组密码子使用频率进行比较，结果显示Df4CL基因密码子与大肠杆菌、酵母、烟草的差异较大，要想在其内表达，还需经过密码子优化，Df4CL基因更适合在拟南芥中表达。这一结果可以为今后Df4CL基因在宿主中实现较高水平表达的研究确立方向，也可为通过优化密码子提高基因的表达量提供依据。

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