2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.10.016 |
2. 浙江中医药大学第一临床医学院, 浙江 杭州 310053 ;
3. 浙江中医药大学附属第一医院 中心实验室, 浙江 杭州 310006 ;
4. 浙江中医药大学附属第一医院 病理科, 浙江 杭州 310006
, YANG Xin-yan2, YANG Xue-jing3, ZHANG Chun-li4, CAO Jun-min3, LI Yan-ping3, LI Shan2
2. First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China ;
3. Central Laboratory, First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China ;
4. Department of Pathology, First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的一种类型，其发病与自身免疫异常相关[1]。目前的治疗以氨基水杨酸、类固醇激素与免疫抑制剂3类药物为主[2-3]，但是无法有效的防治，不可长期使用。近年来，大量研究以中药复方、单味药或者活性成分为研究对象，以期开发出治疗、预防溃疡性结肠炎的新型药物。雷公藤多苷片（Tripterygium wilfordii Polycoride Tablet，TWPT）是以雷公藤多苷为主要成分的口服制剂，临床上发现其具有免疫调控及抗炎作用，被应用于治疗一些自身免疫性疾病[4-5]，但其对UC的作用及作用机制至今尚未明确。
目前对于TLR4/MyD88依赖信号通路在UC发病中的地位已得到重视[6]，既往文献提示微小RNA（miR-146a和miR-146b）与该信号通路密切相关，参与调控肠道内的炎症反应[7]。因此，本实验尝试通过2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇诱导UC大鼠模型作为研究对象，观察TWPT的抗炎作用，并通过检测miR-146a、miR-146b及TLR4/MyD88依赖信号通路的表达情况来探讨TWPT的抗炎作用机制，为TWPT治疗UC提供理论依据。
1 材料 1.1 动物SPF级雄性Wistar大鼠90只，体质量（200±20）g，动物合格证号2007000556038，由浙江中医药大学动物中心提供，常规饲养。
1.2 药物TWPT（浙江德恩制药有限公司生产，批号1311108B，每克雷公藤多苷片原料粉中含有4.17 mg雷公藤内酯甲、0.176 mg雷公藤甲素）；硫唑嘌呤片（AZA，上海医药集团有限公司信谊制药总厂生产，批号008953）。
1.3 试剂与仪器5% TNBS（Sigma公司）；10%水合氯醛（浙江省中医院）；无水乙醇（杭州龙山精细化工有限公司）；中心静脉导管（上海景年医疗器械有限公司）； miR-146a、miR-146b引物（上海伯豪生物技术有限公司设计）；Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF-6）、核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）PCR引物由Takara公司合成；β-actin、NF-κB抗体（Cell Signaling Technology）；TLR4抗体、MyD88抗体、TRAF-6抗体、IL-1β抗体（Abcam）；TNF-α抗体（R&D）；兔二抗；羊二抗；电泳仪及电泳槽（Bio-rad）；RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒（Takara，Shiga，日本）；PCR扩增仪（Applied Biosystems，Foster City，CA，美国）。
2 方法 2.1 分组将90只健康Wistar大鼠随机分为6组，分别为对照组，模型组，TWPT低、中、高剂量（30、60、120 mg/kg）组，AZA阳性对照组，每组15只。
2.2 模型制备大鼠适应性喂养1周，使体质量达到（200±20）g，禁食24 h。10%水合氯醛3 mL/kg ip麻醉后，将石蜡油润滑过的深静脉置管由肛门缓慢插入结肠约8 cm处，模型组和药物组按每只大鼠0.02 mL/kg 5% TNBS＋0.25 mL 50%乙醇进行灌肠，对照组按0.02 mL/kg生理盐水＋0.25 mL生理盐水进行灌肠，灌肠结束加推0.3 mL空气，用棉签堵住大鼠肛门，轻揉大鼠腹部1 min并倒置5 min，造模结束后将大鼠平放，自然清醒后常规饮食。3 d后评价模型成功与否，具体造模成功标准：造模后2 d内大鼠出现精神倦怠甚至萎靡、懒动、进食明显减少，嗜卧伴消瘦、毛发脏乱、失去光泽，腹泻，大便次数增多，肛周皮毛污秽黏腻，粪便稀烂及血便。
2.3 给药对照组、模型组ig给予0.1 mL/kg生理盐水； AZA组：将AZA研成细末，在细末中加生理盐水制成混悬液，按大鼠AZA 60 mg/kg的剂量ig给药； TWPT低、中、高剂量组：将TWPT研成细末，在细末中加生理盐水制成混悬液，分别按30、60、120 mg/kg的剂量分别ig给药。以上药物在造模3 d后开始给药，每天1次，连续给药14 d。
2.4 观察项目每日观察大鼠体质量、毛发、饮食、大便等一般情况，并进行隐血试验及疾病活动指数（DAI）评分[6]。
2.5 标本采集末次给药24 h后，处死大鼠，各组大鼠均留取距肛门8 cm、前后各多保留0.5 cm的结肠组织进行相关检测。
2.6 观察指标及检测方法 2.6.1 结肠炎症评价①DAI评分：按照Fitzpatrick等[8]提出的标准，通过结合给药l4 d后大鼠体质量下降百分率、大便性状及大便隐血情况进行评分；②大体形态损伤评分：参照Wallace等[9]提出的标准进行评分；③镜下结肠损伤评分：取病变组织进行HE染色，按照Geboes等[10]提出的评分标准进行评分。
2.6.2 qRT-PCR法测定miR-146a及miR-146b的表达情况按RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，重复测定3次，取500 ng RNA按反转录试剂盒说明书（QIAGEN，美国）进行逆转录反应合成cDNA，用ABI 7500 PCR仪（Applied Biosystems，Foster City，CA，美国）按RT-PCR说明书将cDNA进行PCR扩增，以U6为内参，以95 ℃预变性30 s，然后进行循环扩增，95 ℃变性5 s，60 ℃退火加延伸30 s，共40个循环，反应结束后进行熔解曲线分析。miRNA的相对表达量以2−ΔΔCt的形式表示。miR-146a及miR-146b的引物由上海伯豪生物技术有限公司设计。miR-146a、miR-146b引物序列见表 1。
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表 1 miR-146a和miR-146b引物序列 Table 1 Primer sequences for miR-146a and miR-146b |
2.6.3 RT-PCR法测定TLR4/MyD88信号通路相关分子mRNA表达水平
所取标本按RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，重复测定3次，取500 ng RNA按反转录试剂盒说明书进行逆转录反应合成cDNA，用ABI 7500 PCR仪按RT-PCR说明书将cDNA进行PCR扩增，以β-actin为内参，以95 ℃预变性30 s，然后进行循环扩增，95 ℃变性5 s，60 ℃退火加延伸30 s，共40个循环，反应结束后进行熔解曲线分析。采用2−ΔΔCt法分析目的基因的相对表达水平。各信号mRNA分子引物情况见表 2。
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表 2 各信号分子引物情况 Table 2 Primers for each signaling molecules |
2.6.4 Western blotting法测定TLR4/MyD88信号通路相关蛋白表达水平
将所取肠组织标本研磨粉碎后，加入6倍量冷蛋白裂解液[20 mmol/L Tris/HCl（pH 7.5），10 mmol/L APMSF，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT]制成缓冲液。取一定量蛋白上样，于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离的蛋白质转移至PVDF膜。5%脱脂奶封闭2 h，加入TLR4（1∶500）、MyD88（1∶1 000）、TRAF-6（1∶500）、NF-κB（1∶1 000）、TNF-α（1∶5 000）、IL-1β（1∶2 500）单克隆抗体，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜5 min×3次。分别加入相应荧光二抗（1∶15 000），室温缓慢震摇2 h，TBST洗膜5 min×3次。采用Odyssey曝光机进行图像显影，Odyssey软件进行图像数据分析，目的蛋白的表达值为目的蛋白的灰度值与β-actin灰度值的比值。
2.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件处理数据。数据以
与对照组相比，模型组肠壁与周围组织粘连，肠管增粗，剖开可见溃疡灶，溃疡病变处肠壁增厚，周边黏膜充血水肿，镜下结肠黏膜水肿，黏膜层及浆肌层可见多量淋巴细胞，浆细胞及中性粒细胞浸润，明显的隐窝脓肿，溃疡形成，溃疡表面可见坏死层，肉芽组织形成；TWPT各剂量组及AZA组肠壁与周围组织粘连较轻或无，溃疡少见，隐窝结构基本完整，中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞少量浸润，其中TWPT高剂量组、AZA组肠壁与周围组织少有粘连，肠管未见明显增粗，肠壁轻度增厚，剖开未见明显溃疡，有轻度黏膜充血水肿，镜下黏膜主要表现为中度慢性炎症，部分黏膜及黏膜下层有少量炎性细胞浸润。治疗14 d后，与对照组相比，模型组大鼠DAI、大体形态损伤以及组织学评分明显增加（P＜0.001）；与模型组相比，TWPT高剂量组及AZA组结肠炎症评分均有明显降低（P＜0.001）；与AZA组相比，TWPT高剂量组结肠炎症评分无显著性差异（P＞0.05）。远端结肠组织大体图见图 1，病理图见图 2，具体炎症评分见表 3。
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图 1 远端结肠组织大体图 Fig.1 General pictures of distal colon tissue |
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图 2 远端结肠组织病理图 Fig.2 Pathological pictures of distal colon tissue |
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表 3 TWPT对UC大鼠结肠炎症评分的影响 ( |
3.2 结肠组织miR-146a及miR-146b表达水平
与对照组相比，模型组大鼠结肠组织中miR-146a和miR-146b表达明显增加（P＜0.01）。与模型组相比，TWPT及AZA均可显著抑制miR-146a、miR-146b表达（P＜0.05、0.01）。从抑制强度而言，TWPT中剂量组对miR-146a、miR-146b的抑制作用最强，TWPT高剂量组略弱于TWPT中剂量组（P＜0.05）。各组结肠组织中miR-146a和miR-146b的表达情况见图 3。
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图 3 各组结肠组织中miR-146a及miR-146b的表达( |
3.3 结肠组织TLR4/MyD88依赖信号通路相关分子mRNA的表达
对TLR4/MyD88依赖信号通路的各节点分子mRNA表达水平（TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB、 TNF-α、IL-1β）而言：与对照组相比，模型组中这些重要节点分子的mRNA表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。与模型组相比，TWPT呈剂量依赖性地抑制该信号通路上各节点分子mRNA的表达，其中TWPT高剂量组中各节点分子mRNA表达水平显著低于模型组（P＜0.05、0.01）。TWPT高剂量组对TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB mRNA表达的抑制作用略强于AZA组，而对该信号通路的末端炎症因子IL-1β及TNF-α mRNA水平的抑制作用却略逊于AZA组，但上述2种差异均无统计学意义（P＞0.05）。各组结肠组织中TLR4/MyD88依赖信号通路相关mRNA的表达情况见图 4。
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图 4 各组结肠组织中TLR4/MyD88依赖信号通路相关分子mRNA的表达 ( |
3.4 结肠组织TLR4/MyD88依赖信号通路相关蛋白的表达
对TLR4/MyD88依赖信号通路的各节点分子蛋白表达水平（TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB、 TNF-α、IL-1β）而言：与对照组相比，模型组中这些重要节点分子的蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，TWPT呈剂量依赖性地抑制该信号通路上各节点分子蛋白的表达，其中TWPT高剂量组中各节点分子蛋白表达水平显著低于模型组（P＜0.01）。与AZA组比较，TWPT高剂量组对该信号通路上游因子（TLR4、MyD88、 TRAF-6、NF-κB）蛋白表达的抑制作用略好于AZA组，而对该信号通路的末端炎症因子IL-1β及TNF-α蛋白水平的抑制作用却略逊于AZA组，但上述2组差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见图 5和6。
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图 5 Western blotting法检测TLR4/MyD88依赖信号通路相关蛋白条带图 Fig.5 Western blotting analysis of related proteins in TLR4/MyD88 dependent signaling pathway |
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图 6 各组结肠组织中TLR4/MyD88依赖信号通路相关蛋白的表达 ( |
4 讨论
TNBS/乙醇UC大鼠模型是研究UC的极佳模型，其炎症反应与TNBS引起的免疫异常反应密切相关[11]。本研究在TNBS/乙醇灌肠造模后，观察模型组造模后一般情况，发现造模2 d后模型组大鼠出现精神、饮食、毛发、大便次数及性状的改变，隐血测试阳性。造模后DAI评分浮动于7～13分，较对照组显著升高，实验结束后解剖大鼠，观察其结肠组织，均可见病变部位组织与周围组织粘连，有较多、较大的溃疡病灶，周围组织充血水肿，高倍镜下可见结肠黏膜水肿，黏膜层及浆肌层可见大量炎症细胞浸润，溃疡形成，溃疡表面可见坏死层，肉芽组织形成，结肠组织大体形态及镜下组织病理学评分较对照组均有显著升高（P＜0.01），证实本研究TNBS/乙醇方法制备大鼠溃疡性结肠炎模型成功。
用TWPT进行3 d的ig治疗后，可见大鼠精神状态开始好转，进食、饮水量及活动量较模型组好转明显，ig 8 d后，大便逐渐成形，偶有稀便，肛周皮毛稍粘，但无便血，体质量有所恢复。实验结束后观察大体形态可见，TWPT高剂量组大鼠肠道黏膜溃疡、炎症状态较模型组改善明显（P＜0.01）；光镜下可见与模型组相比，TWPT高剂量组淋巴细胞、中性粒细胞、浆细胞等炎性细胞浸润减少，偶可见溃疡，溃疡较浅表（P＜0.01）；与AZA组镜下组织学评分有所降低（P＜0.05），大体评分略高（P＞0.05）。提示TWPT对UC大鼠临床症状的改善上及黏膜愈合上具有一定作用，该作用与AZA相比相当或强于AZA。
MicroRNA（miRNA）是一种由19～22个核苷酸组成的非编码微小内源性RNA，它可以作用于3’非编码区（3’untranslated region，3’UTR），最终通过抑制mRNA转录或目标mRNA降解的方式，调控基因表达[12]。因miRNA绑定方式的多样性，miRNA在UC发病过程中扮演重要角色[13]。研究表明miR-146a、miR-146b大多作为一种保护因子，抑制肠道炎症的发生[14-15]。而与以往的文献研究不同，本研究发现：与对照组相比，TNBS/乙醇UC大鼠模型中miR-146a和miR-146b表达明显增加（P＜0.01）。与模型组相比，药物TWPT及AZA均可显著抑制miR-146a和miR-146b（P＜0.01）。从抑制强度而言，TWPT中剂量组对miR-146a和miR-146b的抑制作用最强，TWPT高剂量组略逊于TWPT中剂量组（P＜0.05）。该现象可能提示，TWPT对miR-146a和miR-146b的作用存在一定剂量限制性。
与此同时，本研究分别从蛋白及mRNA水平探讨TLR4/MyD88依赖信号通路在炎症发生中的变化，以及TWPT对此的影响。
由于TLR4可以识别病原体相关分子模式或损伤相关分子模式，经过中间接头蛋白的介导激活相关信号激酶，导致转录因子活化，从而使炎症效应分子转录表达，完成天然免疫应答或激活获得性免疫反应和炎症反应。TLR4信号通路按是否需要接头蛋白MyD88介导，主要分MyD88依赖和非依赖的信号通路[16]。在MyD88依赖的通路中，TLR通过MyD88募集和活化下游白介素-1受体相关激酶4（interleukin-1 receptorassociatedkinase 4，IRAK4）、白介素-1受体相关激酶1（interleukin-1 receptor- associated kinase 1，IRAK1）、白介素-1受体相关激酶2（interleukin-1 receptor-associated kinase 2，IRAK2）和TRAF-6，进而激活丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、干扰素调节因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）和NF-κB通路完成末端炎症因子IL-1β、TNF-α的转录、释放[17]。因此，本研究将TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB作为检测分子，能反映TLR4/MyD88依赖信号通路在炎症发生中的改变，并通过对末端炎症因子IL-1β及TNF-α的检测来阐述该信号通路对炎症因子的调控作用。
针对TLR4/MyD88依赖信号通路的上游分子（TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB）而言，Western blotting及RT-PCR结果均显示：与对照组相比，该信号通路上游分子无论在mRNA水平还是蛋白水平，模型组表达显著升高（P＜0.01）。提示该疾病模型与TLR4/MyD88依赖信号通路的异常表达密切相关。与模型组相比，TWPT呈剂量依赖性地抑制该信号通路的上游因子，其中高剂量组与模型组具有显著差异（P＜0.05）。同时，TWPT对TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB组成的级联反应无论在mRNA及蛋白水平，其抑制趋势均呈现递减现象，且蛋白水平更典型。与阳性对照AZA组比较，高剂量TWPT对该信号通路上游因子的抑制作用略好于AZA组，但无显著性差异（P＞0.05）。提示TWPT与AZA均能通过抑制TLR4/MyD88依赖信号通路来达到抗炎的目的，TWPT对该信号通路的抑制程度略好于AZA，抑制TLR4/MyD88依赖信号通路为TWPT抗炎的途径之一。
末端炎症因子的Western blotting及RT-PCR结果均显示：与对照组相比，该信号通路末端炎症因子IL-1β及TNF-α无论在mRNA水平还是蛋白水平模型组表达显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，TWP呈剂量依赖性地抑制该信号通路的末端炎症因子IL-1β及TNF-α，其中高剂量组与模型组具有显著差异（P＜0.01）。与阳性对照AZA比较，高剂量TWPT对该信号通路末端炎症因子IL-1β及TNF-α的抑制作用略逊于AZA组，但无显著性差异（P＞0.05）。提示TWPT与AZA均对末端炎症因子IL-1β及TNF-α具有抑制作用。与抑制TLR4/MyD88依赖信号通路的上游分子作用程度相比，TWPT对末端炎症因子IL-1β及TNF-α的抑制作用未显示略好于AZA的趋势。这些现象提示，药物对信号通路调控的复杂性，这些复杂性可能会影响到药物最终的抗炎结果。
研究结果提示，中剂量TWPT对miR-146a和miR-146b的抑制作用最强，高剂量TWPT略逊于中剂量，但无显著差异（P＞0.05）。与TWPT抑制TLR4/MyD88依赖信号通路及末端炎症因子作用与剂量呈正相关不同，TWPT对miR-146a和miR-146b的作用未表现出这种正相关的趋势。既往文献提示miR-146a和miR-146b的抑制作用也并非局限在TLR4/MyD88依赖信号通路上，它也可通过抑制SHH信号发挥抗炎作用[18]，这提示TWPT调控miRNAs及信号通路作用也应具有复杂性，有待进一步研究。
综上所述，本研究显示在TNBS/乙醇UC大鼠模型中，TWPT能通过抑制miR-146a和miR-146b的表达，并能抑制TLR4/MyD88依赖信号通路及炎症因子IL-1β及TNF-α释放，对信号通路及炎症因子的作用强度与剂量呈正相关。
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