龙葵Solanum nigrum L. 属茄科（Solanaceae）茄属Solanum L.，一年至多年生草本植物，又名苦菜、苦葵等，为中国传统中药，全国各省区均有一定的分布。龙葵以全草入药，性寒、味苦、微甘，有小毒，具有清热解毒、活血消肿等功效。此外，龙葵在我国长期作为一种抗肿瘤中药在肿瘤疾病治疗中使用，许多抗肿瘤中药复方中均含有龙葵成分。药理学研究发现龙葵的水提物、醇提物等不同组分的提取物具有很强的体外抗肿瘤细胞活性^{[1, 2, 3]}，其水提物还具有活体肿瘤的抑制活性^[4]。龙葵中具有抗肿瘤活性的成分主要包括龙葵碱、澳洲茄碱和澳洲茄边碱等。此外，龙葵多糖、糖蛋白等成分也被证明具有一定的药理活性^{[5, 6, 7, 8, 9]}。还有一些研究涉及到多酚、糖蛋白等成分抗肿瘤细胞的机制，如对AP-1信号通路和细胞周期的影响^{[5, 10]}。但是，尽管龙葵已经是一种广泛应用的传统中药，因其在中国分布广泛，而又缺乏不同地区种质资源和道地性产区的评价研究，使得龙葵资源的规范化应用及功能因子筛选存在一定的问题，如澳洲茄碱在不同产地的龙葵之间的量差异很大^[11]，因此迫切需要对中国龙葵资源现状进行分析、评价。本研究拟以目前在植物资源评价领域广泛应用的DNA条形码技术为工具，并选取在中药材种质资源评价中应用最为广泛的ITS和trnH-psbA 2个DNA条形码序列^[12]，对中国主要龙葵产区的龙葵资源进行系统发育分析，以期归纳出不同的龙葵种质类群，为龙葵资源的利用和道地性评价提供较好的理论基础。

17个龙葵样品采集自黑龙江至海南的主要龙葵产区，均为野外采集新鲜龙葵嫩叶，并用变色硅胶封存，保存于−80 ℃冰箱中。所有的龙葵S. nigrum L. 样品均经浙江农林大学林业与生物技术学院阎道良副教授鉴定。龙葵样品的采集地及其海拔、纬度等信息见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 采集到的龙葵样本及其信息 Table 1 Collected S. nigrum samples and their informations 编号 样品 采集地 纬度 海拔/m 1 HLJ-HEB 黑龙江哈尔滨 N 45°26′ 110.42 2 BJ-HD 北京市海淀区 N 40°15′ 32.12 3 HeB-BD 河北保定 N 39°31′ 20.05 4 HeB-XT 河北邢台 N 37°11′ 19.55 5 HeN-ZK 河南周口 N 36°28′ 27.33 6 HeN-PDS 河南平顶山 N 33°35′ 45.20 7 HuN-SY 湖南邵阳 N 27°14′ 24.81 8 ZJ-HZ 浙江杭州 N 30°27′ 33.74 9 ZJ-JH 浙江金华 N 29°06′ 40.09 10 ZJ-WZ 浙江温州 N 27°20′ 24.48 11 JX-YT 江西鹰潭 N 28°15′ 37.82 12 JX-GZ 江西赣州 N 25°07′ 41.06 13 FJ-XM 福建厦门 N 24°27′ 19.52 14 GX-YL 广西壮族自治区玉林 N 22°44′ 88.36 15 GD-GZ 广东广州 N 23°11′ 34.51 16 GD-MZ 广东梅州 N 23°23′ 27.38 17 HaN-DZ 海南儋州 N 19°11′ 25.39

表 1 采集到的龙葵样本及其信息 Table 1 Collected S. nigrum samples and their informations

1.2 试剂及仪器

ABI 2700型PCR仪，购自美国ABI公司；ELIX3型制水机，购自美国Millipore公司；琼脂糖凝胶电泳系统购自北京六一仪器厂；生物凝胶成像系统，购自美国Bio-rad公司。

引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；TaKaRa Taq^TM DNA聚合酶，购自日本TaKaRa公司；pMD-19克隆载体购自日本TaKaRa公司；DH5α感受态细胞购自北京索莱尔博奥生物科技有限公司；CTAB、酵母提取物、胰蛋白胨等DNA提取和大肠杆菌培养所需试剂购自生工生物工程（上海）有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等常规分析纯试剂购自浙江常青化工有限公司。

用改良的CTAB法分别提取17个龙葵样品的基因组DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取到的基因组DNA的质量。用PCR的方法扩增基因组DNA中相应的DNA条形码片段，其中ITS序列扩增28 S rDNA部分序列至18 S rDNA部分序列的片段，其中包含ITS1和ITS2的全长序列，而trnH-psbA序列扩增trnH基因部分片段至psbA基因部分片段的序列，包含trnH-psbA间区的全长序列。扩增所用的引物序列如下：SnITS-F：5’-TCGTAAC- AAGGTTTCCGTAGGTGA-3’；SnITS-R：5’-GCGG- TCGGAGCGCCTAA-3’；SntrnH-psbA-F：5’-ACTG- CCTTGATCCACTTGGC-3’； SntrnH-psbA-R：5’-A- TAACTTCCCTCTAGACCTAGCTGC-3’。

其中SnITS-F、SnITS-R的参考序列：KC540794；SntrnH-psbA-F、SntrnH-psbA-R的参考序列：KT223790。

按照TaKaRa Taq^TM DNA聚合酶的说明书配制反应体系。ITS序列的PCR扩增反应条件为95 ℃、3 min；95 ℃、20 s，62.5 ℃、20 s，72 ℃、1 min，35 个循环；72 ℃、3 min。trnH-psbA序列的PCR扩增反应条件为95 ℃、3 min；95 ℃、20 s，57 ℃、20 s，72 ℃、45 s，35个循环；72 ℃、3 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用生物电泳凝胶成像系统采集图片。

用1%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物中的目的DNA片段，用Axygen凝胶回收试剂盒纯化相应的DNA片段。纯化后的片段与pMD-19载体构建重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后铺板于LB固体培养基平板，于37 ℃培养10 h。单克隆菌斑形成后挑取菌斑并37 ℃恒温摇床210 r/min培养5 h，用“1.3”项中的PCR方法检测菌液中的DNA插入片段。将有插入片段的菌液送生工生物工程（上海）有限公司进行插入片段测序，为保证测序的准确度，每样品送3份样品并双向测序。

将测序得到的序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中的龙葵近缘种的相关序列进行比对，分别整理出其中的ITS1、ITS2和trnH-psbA的序列。采用菲岛茄Solanum cumingii Dunal 的ITS1＋ITS2序列为ITS1＋ITS2系统发育树的外群，采用番茄Solanum lycopersicum L.的trnH-psbA序列为trnH-psbA系统发育树的外群。用MEGA（version 4.1）软件中的邻接法（NJ）和最大简约法（MP）构建龙葵物种的系统发育树。采用MEGA（version 4.1）软件中的Kimura two-parameter模型分析不同样品龙葵ITS1、ITS2和trnH-psbA序列的遗传距离。用Clustal X和DNA man软件对不同样品龙葵ITS1、ITS2和trnH-psbA序列进行多重比对。

为全面而准确地比对龙葵物种的ITS和trnH-psbA序列，本实验分别扩增了17个龙葵样品的ITS和trnH-psbA区段DNA序列。ITS区段包括部分28 S rDNA序列＋ITS1全长＋5 S rDNA全长＋ITS2全长＋部分28 S rDNA序列，而trnH-psbA区段包括部分trnH基因＋trnH-psbA间区全长＋部分psbA基因。由图 1可见，17个样品中的ITS和trnH-psbA序列扩增均得到特异性的单一条带，且条带大小与各自DNA序列的预计相对分子质量大小一致。提取其中的ITS1、ITS2和trnH-psbA序列后进行序列分析，发现17个龙葵样品的ITS1序列均为230 bp，ITS2序列均为206 bp。对于trnH-psbA序列，来自黑龙江哈尔滨和北京海淀等的6个样品为447 bp，而来自湖南邵阳、浙江金华等的11个样品为446 bp。这些样品的ITS序列在G＋C量等方面较为接近，见表 2。

图 1 17个龙葵样本的ITS (A) 及trnH-psbA (B) 扩增条带 Fig.1 ITS (A) and trnH-psbA (B) amplified fragment of 17 samples of S. nigrum

表 2(Table 2)

表 2 17个龙葵样品的ITS和trnH-psbA序列长度和碱基频率分布 Table 2 Length and base pair frequency in ITS and trnH-psbA sequences from 17 samples of S. nigrum 编号 ITS1 ITS2 trnH-psbA 长度/bp (G＋C)/% 长度/bp (G＋C)/% 长度/bp (G＋C)/% 1 230 66.52 206 66.50 447 27.29 2 230 66.52 206 66.50 447 27.29 3 230 66.52 206 66.50 447 27.29 4 230 66.52 206 66.50 447 27.29 5 230 66.52 206 66.50 447 27.29 6 230 66.52 206 66.50 447 27.29 7 230 66.52 206 67.48 446 27.35 8 230 66.52 206 67.48 446 27.35 9 230 66.52 206 67.48 446 27.35 10 230 66.52 206 67.48 446 27.35 11 230 66.52 206 67.48 446 27.35 12 230 66.52 206 67.48 446 27.35 13 230 66.52 206 67.48 446 27.35 14 230 66.52 206 67.48 446 27.35 15 230 66.09 206 67.48 446 27.35 16 230 66.09 206 67.48 446 27.35 17 230 65.65 206 67.48 446 27.35

表 2 17个龙葵样品的ITS和trnH-psbA序列长度和碱基频率分布 Table 2 Length and base pair frequency in ITS and trnH-psbA sequences from 17 samples of S. nigrum

2.2 龙葵ITS和trnH-psbA序列的系统发育分析

以菲岛茄的ITS1＋ITS2序列（序列号EU176116）和番茄的trnH-psbA序列（序列号GU562406）为外群，用邻接法分别基于龙葵ITS1＋ITS2和trnH-psbA序列构建系统发育树（图 2），从而对龙葵种质资源进行聚类。结果显示，用两个序列均可将龙葵资源分为3个主要的类群，分别为来自黑龙江哈尔滨、河北保定、河北邢台、北京海淀、河南平顶山和河南周口的样品组成的类群；浙江温州、浙江金华、浙江杭州、江西赣州、湖南邵阳、福建厦门、江西鹰潭、广西玉林的样品组成的类群；广东梅州、广东广州、海南儋州的样品组成的类群。但是相对trnH-psbA序列，ITS1＋ITS2序列构建的系统发育树对不同种质的龙葵样品分离程度更好。

图 2 基于ITS1＋ITS2和trnH-psbA序列的龙葵种质资源系统发育树 Fig.2 Phylogenetic trees of seed resources for Chinese S. nigrum based on ITS and trnH-psbA sequences

2.3 龙葵ITS和trnH-psbA序列的遗传距离

对17个龙葵样本之间的遗传距离进行分析（表 3和4），发现无论是ITS1＋ITS2还是trnH-psbA序列，这些样本之间的遗传距离均较小，尤其对于trnH-psbA序列。对于ITS1＋ITS2序列，湖南邵阳、福建厦门、广西玉林、江西鹰潭和江西赣州5个样品之间的遗传距离是0。同样还有来自北京和河北邢台、保定的3个样品，之间的遗传距离也为0。而广东梅州样本与北京、河北和黑龙江的4个样本的遗传距离均为0.016，为最大遗传距离。trnH-psbA序列也具有类似的规律。

表 3(Table 3)

表 3 17个龙葵样本的ITS (ITS1＋ITS2) 序列的K2-P模型遗传距离 Table 3 K2-P model genetic distances of ITS sequences among 17 samples of S. nigrum 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 0.000 2 0.000 0.000 3 0.000 0.000 0.000 4 0.000 0.000 0.000 0.000 5 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 6 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 7 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.000 8 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.000 0.000 9 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.000 0.000 0.000 10 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000 11 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 12 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 13 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 14 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 15 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.000 16 0.016 0.016 0.016 0.016 0.016 0.016 0.013 0.013 0.013 0.013 0.013 0.013 0.013 0.013 0.005 0.000 17 0.013 0.013 0.013 0.013 0.013 0.013 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.002 0.004 0.000

表 3 17个龙葵样本的ITS (ITS1＋ITS2) 序列的K2-P模型遗传距离 Table 3 K2-P model genetic distances of ITS sequences among 17 samples of S. nigrum

表 4(Table 4)

表 4 17个龙葵样本的trnH-psbA序列的K2-P模型遗传距离 Table 4 K2-P model genetic distances of trnH sequences among 17 samples of S. nigrum 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 0.000 2 0.000 0.000 3 0.000 0.000 0.000 4 0.000 0.000 0.000 0.000 5 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 6 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 7 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 8 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 0.000 9 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 10 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 11 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 12 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 13 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 14 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 15 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 16 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 0.000 17 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000

表 4 17个龙葵样本的trnH-psbA序列的K2-P模型遗传距离 Table 4 K2-P model genetic distances of trnH sequences among 17 samples of S. nigrum

2.4 ITS和trnH-psbA序列的变异位点及规律分析

对不同样本的ITS1和ITS2序列进行分析，发现其变异位点均具有明显的规律性（图 3）。其中ITS1区段存在7个变异位点，均发生在广东广州、广东梅州和海南儋州采集样品与其他14个样品之间，其中包括5个简约信息位点和2个单一变异位点。而5个简约信息位点中包含4个位点为碱基“C”与“T”的互换。变异频次最高的为广东梅州的样品，发生了全部7个位点的碱基变异。ITS2区段存在2个变异位点，均为简约信息位点。ITS2区段的变异主要产生在浙江杭州、浙江温州等9个样品与其他样品之间，2个变异的位点分别是发生了“C”-“A”和“C”-“T”之间的碱基互换。trnH-psbA序列产生了3个变异位点，其中第1个是发生在海南儋州等3个样品与其他14个样品之间的“A”-“T”碱基互换；第2和第3个均发生在海南儋州、广东梅州等11个样品与北京海淀、河南周口等6个样品之间，分别为“G”-“T”之间的碱基互换和碱基“G”的缺失。

图 3 17个龙葵样本的ITS和trnH-psbA序列多重比对结果 Fig.3 Multi-alignment of ITS and trnH-psbA sequences from 17 samples of S. nigrum

3 讨论

道地药材对中药资源的利用具有不可忽视的重要意义，但是由于历史的原因和科技发展水平等的影响，时至今日，对中药道地性的认识还基本停留在产地、性状、生态和功能等方面，而缺乏对其本质及规律性的认识。随着分子生物学技术在传统中药领域的应用，越来越多的学者尝试用一些新的方法评价道地药材^{[13, 14, 15]}。另一方面，DNA条形码技术在包括中药材在内的植物种质资源评价领域已经取得相当普及的应用^{[16, 17]}，那么，这一准确、客观、便捷的植物种质资源鉴定技术能否作为一种基础或辅助手段应用于道地性药材评价领域？这是本研究思考的一个重要问题。

传统抗肿瘤中药龙葵在中国分布广泛，但是缺乏道地产区的认证，造成龙葵种质资源良莠不齐。因而对龙葵种质资源进行评价将对这一传统中药的更合理利用提供指导性的价值。本实验将DNA条形码技术应用于龙葵种质资源的聚类研究，扩增ITS1＋ITS2和trnH-psbA 2个植物种质资源鉴定中最常采用的DNA条形码序列，用系统发育方法分析来自主要龙葵产区的17个样本。聚类分析的结果显示，龙葵资源可以基本上分为3个类群，一个是来自较高纬度的东北、华北等地区（黑龙江、河北、河南、北京）的资源；第2个是来自中间纬度的华东和中部地区（浙江、湖南、江西）的资源，甚至还包括广西、福建等地区的资源；第三个是来自较低纬度地区（广东、海南）的资源，因此推测龙葵资源的系统发育对纬度有一定的依赖性。这一结果和之前报道的不同纬度来源的龙葵中澳洲茄碱的量显著不同的结论相印证^[11]。本研究的结果为进一步评价龙葵种质资源提供了理论基础，有利于龙葵资源的更合理利用。

本研究对不同种质龙葵资源DNA条形码的聚类分析和遗传距离的分析来看，同一类群内部不同来源的样本之间遗传差异很小，甚至样本之间没有遗传差异，说明同一类群的龙葵样本种质较为一致。本研究分别用ITS1＋ITS2和trnH-psbA 2个DNA条形码对中国龙葵资源进行聚类分析，结果显示聚类结果相似，说明这种方法具有较高的可靠性。而对2个DNA条形码的结果进行分析，发现ITS1＋ITS2对龙葵资源的分离度更高，可能是由于相比trnH-psbA，龙葵的ITS序列拥有更快的进化速率，因此可以更准确的反映龙葵的进化状态。结果说明ITS1＋ITS2更适合用来进行龙葵资源鉴定。

本研究发现，不同地区龙葵资源的ITS序列的变异位点具有明显的规律性。以ITS2为例，17个龙葵样品的变异均发生在2个位点，且发生在广东、浙江、湖南、江西等中低纬度类群与河北、北京、黑龙江等高纬度类群之间。而对于ITS1，则有更多的碱基位点在不同的样品间发生了变异，变异类型以“C”-“T”转换为主。不同于ITS2，ITS1序列突变发生的类群主要产生在广东和海南等低纬度类群与其他类群之间。由此可见，不同地区的龙葵物种，其ITS1和ITS2序列的碱基位点发生了不同程度的变异，这些变异与龙葵分布的纬度有一定的关系。此外，ITS1和ITS2的序列在不同样品间的变异程度并不相同，ITS1序列存在更多的变异位点，而ITS2的变异发生在更多的样品之间。这一现象与其他一些植物物种的2个ITS序列的变异频次并不相同，造成这样2个序列不同步变异的机制有待于更进一步研究。