病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）已成为我国当前最常见的心肌炎，发病率逐年上升，37%可能演变为扩心病，死亡率达12.5%^[1]，迄今仍缺乏特效的治疗方法。柯萨奇病毒B（coxsackievirus B，CVB）属小RNA病毒科肠道病毒属，共分6型，是VMC的主要病原体。血清学和流行病学研究资料显示，25%～50%急性心包炎、36%～65%急性心肌炎患者有近期或复发的CVB感染^{[2, 3, 4]}。疏风解毒胶囊是中药复方，具有疏风清热、解毒利咽之功，主治上呼吸道感染属风热证，症见发热、恶风、咽痛、头痛、鼻塞、流浊涕、咳嗽等^{[5, 6]}。其处方系湖南湘西老中医向楚贤的祖传秘方，对于多种病毒有明显的抑制效果^[7]。本研究旨在探讨疏风解毒胶囊对VMC小鼠心肌组织形态和血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、淀粉样蛋白A（SAA）水平的影响，为临床治疗VMC提供实验依据。

近交系Balb/c小鼠240只，4～6周龄，体质量16～18 g，购于复旦大学医学院实验动物中心，生产许可证SCXK（沪）2014-0004。

CVB₃m，复旦大学附属中山医院心病毒实验中心提供，经感染HeLa细胞传代。

疏风解毒胶囊（批号130601），安徽济人药业有限公司，0.52 g/粒，1粒胶囊溶于50mL水，配成0.01 g/mL溶液；利巴韦林注射液，每支0.1 g/10 mL，批号20140502，辰欣药业股份有限公司；TNF-α、SAA ELISA Kit，上海奥普生物工程公司。

Image Master VDS图像分析系统，美国Phar2 macia Bioech。

含100 TCID₅₀ CVB₃m的Eagle’s液0.2 mL腹腔攻击小鼠，每3～4天攻击1次，连续1周（经预试验确定，小鼠出现心肌炎典型心肌病变的最适剂量为1×10⁴/mL CVB₃m液，ip给予小鼠0.2 mL），复制VMC模型。

取Balb/c小鼠240只，随机分为6组：对照组，模型组，疏风解毒胶囊低、中、高剂量（0.1、0.2、0.5 g/kg）组，利巴韦林（0.1 g/kg）组。对照组ip Eagle’s液0.2 mL，其余各组ip1×10⁴/mL CVB₃m液0.2 mL。接种病毒2h后开始给药，疏风解毒胶囊组ig药物溶液，利巴韦林组ip注射液，对照组、模型组ig等体积的生理盐水，每天给药1次，连续给药7 d。

病毒攻击第4、8天，脱颈椎处死小鼠，无菌剖取心脏，4%多聚甲醛固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察心肌病理变化。Image Master VDS图像分析系统测量病理指标，计算心肌病变评分，即每张切片取5个视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积与整个视野面积之比，无病变计0分，＜25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分，＞75%计4分。

于第4、8天眼眶取血，4 000 r/min低温离心，分离血清，采用Elisa-Kit测定血清TNF-α、SAA水平。

数据均以表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，单因素方差分析，组间比较采用t检验。

病毒感染后第4天，模型组和给药组心肌病理切片均出现数量不等的小炎症灶与点状坏死，给药组相对较轻；第8天，模型组心肌组织炎症及坏死较第4天时加重，出现片状炎症及坏死灶，疏风解毒胶囊组和利巴韦林组病理改变仍以点状炎症及坏死灶为主，病变程度相对较轻；对照组未见类似病理学改变。不同剂量的疏风解毒胶囊心肌病变评分和模型组比较差异显著（P＜0.05），与利巴韦林组比较差异不显著（P＞0.05）。结果见图 1和表 1。

图 1 第8天心肌组织病理变化 Fig.1 pathological changes of cardiac muscle tissue on day 8

表 1(Table 1)

表 1 模型组、疏风解毒胶囊组、利巴韦林组小鼠感染后第4、8天心肌组织病变程度比较 $\left( {\bar x \pm s} \right)$ Table 1 Comparison on degree of cardiac muscle tissue in infected mice of virus group,Shufengjiedu Capsule group,and ribavirin group on days 4 and 8 after infection $\left( {\bar x \pm s} \right)$ 组别 剂量/(g∙kg−1) 第4天 第8天 样本数 评分 样本数 评分 模型 19 2.76±0.62 18 3.05±0.53 疏风解毒胶囊 0.1 20 1.90±0.35△ 19 2.16±0.56△ 0.2 20 1.85±0.43△ 20 2.05±0.41△ 0.5 20 1.78±0.36△ 20 2.10±0.53△ 利巴韦林 0.1 19 1.82±0.60△ 19 2.22±0.52△ 与模型组比较：△P＜0.05 △P < 0.05 vs model group

表 1 模型组、疏风解毒胶囊组、利巴韦林组小鼠感染后第4、8天心肌组织病变程度比较 $\left( {\bar x \pm s} \right)$ Table 1 Comparison on degree of cardiac muscle tissue in infected mice of virus group,Shufengjiedu Capsule group,and ribavirin group on days 4 and 8 after infection $\left( {\bar x \pm s} \right)$

3.2 对血清TNF-α、SAA水平的影响

与对照组比较，模型组与给药组第4、8天血清TNF-α、SAA水平显著升高（P＜0.05）；疏风解毒胶囊0.2、0.5 g/kg剂量组与模型组比较，血清TNF-α、SAA水平显著降低（P＜0.05），与利巴韦林组比较，差异不显著（P＞0.05），结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠血清TNF-α、SAA水平 $\left( {\bar x \pm s} \right)$ Table 2 Serum TNF-α and SAA levels of mice in each group $\left( {\bar x \pm s} \right)$ 组别 剂量/ (g∙kg−1) 第4天 第8天 样本数 TNF-α/(pg∙mL−1) SAA/(mg∙L−1) 样本数 TNF-α/(pg∙mL−1) SAA/(mg∙L−1) 对照 20 5.67±0.35 0.11±0.01 20 5.71±0.32 0.12±0.01 模型 19 22.76±3.62 2.77±0.42 18 33.05±2.53 4.16±0.33 疏风解毒胶囊 0.1 20 20.90±2.35 2.12±0.23 19 32.16±2.56 3.16±0.44 0.2 20 13.85±1.32*△ 1.25±0.13*△ 20 13.91±1.45*△ 2.01±0.21*△ 0.5 20 12.88±1.36*△ 1.23±0.20*△ 20 12.50±1.63*△ 2.05±0.23*△ 利巴韦林 0.1 19 11.62±1.52 1.02±0.21 19 12.24±2.02 1.92±0.31 与对照组比较：P＜0.05；与模型组比较：△P＜0.05 P < 0.05 vs control group; △P < 0.05 vs model group

表 2 各组小鼠血清TNF-α、SAA水平 $\left( {\bar x \pm s} \right)$ Table 2 Serum TNF-α and SAA levels of mice in each group $\left( {\bar x \pm s} \right)$

4 讨论

心肌炎是心肌发生的局限或弥漫性炎症，最常见的病因是肠道病毒感染，其中又以CVB为主。其发病机制尚未完全阐明，目前多认为是病毒直接损伤和免疫反应所致。中医学一般认为VMC是外感六淫之邪侵犯心脏、耗伤气阴或以气阴两虚之体，复感六淫之邪而发病，在“心悸”“怔忡”“虚劳”等证中有类似症状的记载。对VMC发病机制研究的最新进展表明，氧自由基、超氧化物歧化酶（SOD）及相关因素、心肌细胞凋亡、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）均参与了VMC的发病^[4]。疏风解毒胶囊方中虎杖苦微涩、微寒，功能祛风、除湿、解表、攻诸肿毒、止咽喉疼痛，为君药。连翘性凉味苦，功能清热、解毒、消肿，具有升浮宣散之力，能透肌解表、清热祛风，为治疗风热的要药；板蓝根味苦性寒，功能清热解毒，二药共为臣药。柴胡性味苦凉，功具解表和里；败酱草味辛苦，微寒，功能清热、解毒、善除结热；马鞭草性味凉苦，功能清热解毒，能治外感发热、喉痹；芦根味甘寒，能清降肺胃，生津止渴，治喉痛，四药共为佐药。甘草调和诸药为使药。诸药配伍能直达上焦肺卫，祛风清热，解毒散结，切合风热证风热袭表、肺卫失宣、热毒结聚之病机，达到迅速退热的功效^{[8, 9]}。疏风解毒胶囊中剂量作用与利巴韦林作用相当，说明该药能抑制病毒繁殖或是保护心肌免受病毒攻击，从而使疾病早期由病毒直接损伤心肌介导的炎症缓解。

TNF-α是由激活的巨噬细胞或单核细胞等产生的一种具有多种生物学效应的细胞因子。研究发现TNF-α参与了多种病理过程，与许多疾病的发病有关^[10]。近年来的研究表明，在VMC中TNF-α表达明显升高，可能在VMC的心脏损伤和发病机制中起作用^{[11, 12]}。实验表明，TNF-α在VMC的免疫反应和发病机制中起重要作用。Calabrese等^[11]用RT-PCR和免疫组化方法研究了38例心肌炎和8例正常人心肌活检组织中TNF-α的表达，结果表明TNF-α在VMC发病机制中起重要作用，且与心功能不全的严重程度有关。本实验可以观察到疏风解毒胶囊中、高剂量组抑制了TNF-α的表达，改善心肌损伤症状。

SAA是由同一簇基因编码的一组多形性急性时相蛋白，存在于各种哺乳动物和禽类中。许多急性和慢性炎性反应时，血浆SAA水平明显升高，其合成主要受白细胞介素（IL-1）、IL-6、TNF-α和糖皮质激素的调控^[13]，是一个非常敏感的急性时相蛋白^[14]。本实验可以观察到疏风解毒胶囊中、高剂量组对于SAA表达明显的抑制作用，但是具体的作用通路及靶点有待于进一步研究。本实验提示在VMC早期应用疏风解毒胶囊，可抑制病毒、保护心肌，改善预后。