中草药  2015, Vol. 46 Issue (9): 1269-1276
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.09.003
牛艳芬, 崔圆圆, 杨光忠, 陈玉. 石松生物碱成分的研究[J]. 中草药, 2015, 46(9): 1269-1276.
NIU Yan-fen, CUI Yuan-yuan, YANG Guang-zhong, CHEN Yu. Lycopodium alkaloids from Lycopodium japonicum[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2015, 46(9): 1269-1276.
石松生物碱成分的研究
牛艳芬1, 崔圆圆2, 杨光忠2, 陈玉1     
1. 中南民族大学化学与材料科学学院, 湖北 武汉 430074;
2. 中南民族大学药学院, 湖北 武汉 430074
收稿日期: 2015-03-03;
基金项目： 国家科技支撑计划(2012BAI27B06);湖北省自然科学基金和创新群体项目(2013CFB450,2013CFA013)
通讯作者：陈玉,女,博士,副教授,硕士生导师,主要从事天然药物化学的研究。Tel:(027)67842752E-mail:chenyuwh888@126.com
摘要：目的 研究石松Lycopodium japonicum全草的生物碱成分。方法 采用正、反相硅胶柱色谱及半制备型HPLC等技术进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定化合物的结构,并以脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞建立细胞炎症模型,采用Griess法检测一氧化氮(NO)量以评价化合物的抗炎活性。结果 从石松全草甲醇提取物中分离得到19个化合物,分别鉴定为lycoposerramine-M N-oxide(1)、acetyllycoposerramine-M(2)、石松碱(3)、lycoposerramine-M(4)、miyoshianine-C(5)、12-epilycodoline N-oxide(6)、gnidioidine(7)、lycoposerramine-K(8)、光泽石松灵碱(9)、4α-hydroxyanhydrolycodoline(10)、flabelline(11)、hydroxypropyllycodine(12)、石松定碱(13)、去-N-甲基-α-玉柏碱(14)、α-玉柏碱(15)、去-N-甲基-β-玉柏碱(16)、石松佛利星碱(17)、lycoflexine N-oxide(18)和法氏石松定碱(19)。化合物5和18可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的NO释放,其IC50分别为31.82、40.69 μmol/L。结论 化合物1为新化合物,命名为N-氧化石松碱M,化合物2、6、11、12、16、18、19为首次从该植物中分离得到;化合物5和18表现出潜在的抗炎活性。
关键词： 石松     生物碱     抗炎活性     RAW264.7细胞     N-氧化石松碱M     法氏石松定碱    
Lycopodium alkaloids from Lycopodium japonicum
NIU Yan-fen1, CUI Yuan-yuan2, YANG Guang-zhong2, CHEN Yu1    
1. College of Chemistry and Materials Science, South Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China;
2. College of Pharmacy, South Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China
Abstract: Objective To study the chemical constituents in the whole herb of Lycopodium japonicum. Methods The constituents were isolated and purified by silica gel and semi-preparative HPLC, and their structures were elucidated by means of physicochemical properties and spectroscopic analysis. All the isolated compounds were evaluated using relevant in vitro anti-inflammatory assay against LPS-induced NO releases. Results Nineteen compounds were isolated from the whole herb of L. japonicum, and identified as lycoposerramine-M N-oxide (1), acetyllycoposerramine-M (2), lycopodine (3), lycoposerramine-M (4), miyoshianine-C (5), 12-epilycodoline N-oxide (6), gnidioidine (7), lycoposerramine-K (8), lucidioline (9), 4α-hydroxyanhydrolycodoline (10), flabelline (11), hydroxypropyllycodine (12), lycodine (13), des-N-methyl-α-obscurine (14), α-obscurine (15), des-N-methyl-β-obscurine (16), lycoflexine (17), lycoflexine N-oxide (18), and fawcettidine (19). Compound 5 and 18 could inhibit the release of nitric oxide (NO) in the RAW264.7 cell line stimulated by lipopolysaccaride. The IC50 values of 5 and 18 are 31.82 and 40.69 μmol/L, respectively. Conclusion Compound 1 is a new compound, named lycoposerramine-M N-oxide, compounds 2, 6, 11, 12, 16, 18, and 19 are isolated from this plant for the first time. Compounds 5 and 18 exhibit the potent inhibitory activity.
Key words: Lycopodium japonicum Thunb. ex Murray     alkaloids     anti-inflammatiory activity     RAW264.7 cell     lycoposerramine-M N-oxide     fawcettidine    

石松Lycopodium japonicum Thunb. ex Murray是石松科（Lycopodiaceae）石松属Lycopodium L.植物，为传统中药材，全草可入药，有祛风除湿、舒筋活络的功效，主要可治疗关节疼痛、屈伸不利等，广泛分布于我国广东、广西、云南、贵州等省[ 1 ]。石松生物碱类成分表现出良好的抗胆碱酯酶活性而受到广泛关注，截至目前已分离得到300多个石松生物碱[ 2,3,4 ]，近年来，从该属植物中分离得到一些新骨架类型的石松生物碱[ 5,6 ]，研究表明石松生物碱也具有抗肿瘤、抗炎等其他药理活性[ 7,8 ]。在前期工作中本课题组对石松属植物玉柏石松进行了研究，分离得到13个石松生物碱，包括2个新生物碱类化合物[ 9 ]。为进一步寻找新颖结构的石松生物碱，本实验对石松全草进行了系统研究，共分离鉴定了19个生物碱类化合物，其中石松碱类11个：lycoposerramine-M N-oxide（1）、acetyl- lycoposerramine-M（2）、石松碱（lycopodine，3）、lycoposerramine-M（4）、miyoshianine C（5）、12-epilycodoline N-oxide（6）、gnidioidine（7）、lycoposerramine-K（8）、光泽石松灵碱（lucidioline，9）、4α-hydroxyanhydrolycodoline（10）、flabelline（11）；石松定碱类5个：hydroxypropyl-lycodine（12）、石松定碱（lycodine，13）、去-N-甲基-α-玉柏碱（des- N-methyl-α-obscurine，14）、α-玉柏碱（α-obscurine，15）、去-N-甲基-β-玉柏碱（des-N-methyl-β- obscurine，16）；伐斯替明碱类3个：石松佛利星碱（lycoflexine，17）、lycoflexine N-oxide（18）、法氏石松定碱（fawcettidine，19）。其中化合物1为新化合物，命名为N-氧化石松碱M。化合物2、6、11、12、16、18、19为首次从该植物中分离得到。并以脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞建立细胞炎症模型，采用Griess法检测一氧化氮（NO）的量评价了化合物的抗炎活性。化合物5和18可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的NO释放，表现出潜在的抗炎活性，其IC50分别为31.82和40.69 μmol/L。 1 材料与仪器

BrukerAM-400型核磁共振波谱仪（布鲁克公司）；Finnigan MAT 95型质谱仪（美国菲尼根公司）；Perkin-Elmer 341旋光仪（珀金埃尔默公司）；Ultimate 3000型高效液相色谱仪（美国戴安公司）；半制备型色谱柱为5C18-MS-II（250 mm×10 mm，5 μm）；50 μm反相材料ODS（日本YMC公司）；300～400目硅胶和硅胶H-TLC薄层预制板（青岛海洋化工厂）；色谱甲醇和乙腈由美国Tedia试剂公司生产，其余试剂均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司和天津博迪化工有限公司生产；DMEM培养基、胎牛血清（Hyclone，美国），MTT、脂多糖（LPS）、地塞米松（Sigma，美国），Griess检测试剂盒（碧云天公司），酶标仪（Tecan Infinite M200，瑞士）。

石松干燥药材全草，购于安徽亳州中药材市场，由中南民族大学药学院刘新桥博士鉴定为石松Lycopodium japonicum Thunb. ex Murray。 2 实验方法 2.1 提取与分离

石松全草（20.8 kg）粉碎后用120 L甲醇室温浸泡3次，每次24 h。真空抽滤得滤液，减压旋蒸，得甲醇提取物（4.1 kg）。将甲醇提取物用3%酒石酸溶解后用醋酸乙酯萃取，下层水相用饱和Na2CO3调节pH至10后再用醋酸乙酯萃取，此萃取液蒸干，得到碱性醋酸乙酯浸膏（35 g）。将此碱性醋酸乙酯浸膏经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇（95∶5→0∶1）梯度洗脱，TLC分析后合并相同组分，共收集9个组分Fr. A～I。Fr. C（0.8 g）经半制备HPLC纯化得到化合物10（5 mg）和19（6 mg）。Fr. D（2.5 g）经反复正、反相硅胶柱色谱分离和半制备HPLC纯化得到化合物2（80 mg）和13（6 mg）。Fr. E（6.5 g）经反复正、反相硅胶柱色谱分离和半制备HPLC纯化得到化合物3（10 mg）、6（15 mg）、7（5 mg）、8（9 mg）和12（4 mg）。Fr. F（2.0 g）经正、反相硅胶柱色谱分离和半制备HPLC纯化得到化合物14（5.9 mg）、16（30 mg）和17（10 mg）。Fr. G（2.4 g）经过反相硅胶柱色谱分离和半制备HPLC纯化得到化合物1（4 mg）、15（300 mg）、18（13 mg）。Fr. H（2.8 g）经过反相硅胶柱色谱分离和半制备HPLC纯化得到化合物4（12 mg）、5（7 mg）、9（13 mg）和11（5 mg）。 2.2 抗炎活性测试 2.2.1 化合物对细胞活力的影响

细胞活力测定采用MTT法，取对数生长期的RAW264.7细胞，用含10% FBS的DMEM培养基制成1×105个/mL单细胞悬液，接种于96孔板中，置37 ℃、5% CO2培养箱培养至细胞贴壁后，加入不同浓度的化合物，受试化合物终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25 μmol/L，以DMSO为溶剂对照组，37 ℃、5% CO2培养箱培养48 h后，吸去上清液，用含0.5 mg/mL MTT的无血清DMEM孵育3 h后，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，在酶标仪上于492 nm处检测吸光度（A）值，计算细胞存活率。

存活率＝A给药组/A溶剂对照组 2.2.2 化合物对LPS活化的RAW264.7细胞释放NO的影响

取对数生长期的RAW264.7细胞，用含10% FBS的DMEM培养基制成2×105个/mL单细胞悬液，接种于96孔板中，置37 ℃、5% CO2培养箱培养至细胞贴壁后。将细胞分为7组：正常组（不加LPS和化合物）；LPS对照组（LPS终质量浓度为10 μg/mL）；阳性对照组 [LPS终质量浓度为10 μg/mL，地塞米松（DM）终浓度为10 μmol/L]；药物组（根据MTT实验结果，在细胞存活率大于80%的范围内设置4个浓度梯度，分别为50、25、12.5、6.25 μmol/L，且LPS终质量浓度为10 μg/mL）。培养48 h后，收集各孔中的细胞培养液上清，用Griess试剂盒检测上清中NO的量，实验操作按说明书进行。 2.2.3 统计学分析

应用Graphpad prism软件进行处理，数据用x±s表示，采用ANOVA进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。 3 结果 3.1 结构鉴定

化合物1：白色粉末，[α]D27.0 -5.12° (c 0.567,MeOH-CHCl3 1∶1)，由HR-EI-MS得到分子式为C16H25NO3（m/z: 279.183 1 [M]+，计算值279.183 4），EI-MS中由于氧原子的丢失而出现碎片离子峰m/z 263 [M－16]+，表明该化合物含有N-氧化基团。13C-NMR和DEPT谱表明该化合物含1个羰基碳、1个sp3季碳、5个次甲基、8个亚甲基和1个甲基。1H-NMR和13C-NMR中δH 3.14 (1H,brs) 和δC 67.0 (d) 的信号表明该化合物有1个羟基取代，以上数据说明该化合物为单羟基取代的N-氧化石松碱类生物碱。其1H-1H COSY和HSQC谱中分析可见以下3个片段：-CH2CH2CH2CH-(C1-C4)、-CH2CH2CHCH-(C9-C12) -CH2CHCH2CH(CH3)CH2-(C6-C8-C15(C16)-C14)；HMBC谱中可见H-6 (δH 3.36) 与C-4、C-5相关，H-12 (δH 2.23)、H-14 (δH 2.10) 与C-13相关，H-7 (δH 2.37) 与C-5、C-12相关，H-1 (δH 3.56) 与C-9、C-13相关。以上3片段的HMBC相关信号连接见图 1。

图 1 化合物1的重要HMBC、1H-1H COSY和ROESY相关Fig. 1 Key HMBC,1H-1H COSY,and ROESY correlations of compound 1

另外ROESY谱中可见H-11 (δH 4.06) 与H-7 (δH 2.37)、H-9β (δH 2.82) 相关，H-12 (δH 2.23) 与H-8 (δH 1.24) 相关，H-4 (δH 3.69) 与H-9α (δH 4.22) 相关，H-6 (δH 2.11) 与H-15 (δH 1.47) 相关，该化合物的相对构型确定（图 1）。比较化合物1与已知化合物lycoposerramine-M（4）的波谱数据（表 1）[ 10 ]，其主要差别为1的C-1 (δC 63.7),C-9 (δC 54.9),C-13 (δC 75.4) 较4的C-1 (δC 47.3),C-9 (δC 41.7),C-13 (δC 59.5) 向低场移动，这是由于氧原子电负性对氮原子邻位碳的影响而产生的；而1的C-10 (δC 29.2),C-12 (δC 40.9),C-14 (δC 34.6) 较4的C-10 (δC 35.3),C-12 (δC 47.6),C-14 (δC 43.5) 向高场移动，这个变化是由于N-O键对氮原子γ位的γ-gauche效应产生的，这说明化合物1为lycoposerramine-M（4）的N-氧化物。其1H-NMR (400 MHz,CDCl3) 和13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 1。因此确定了化合物1的结构（图 1），并命名为N-氧化石松碱M。

表 1 化合物1和4的1H-NMR (400 MHz,CDCl3) 和13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据 Table 1 1H-NMR (400 MHz,CDCl3) and 13C-NMR (100 MHz,CDCl3)dataof compounds 1 and 4

化合物2：无色柱状晶体（甲醇）。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 5.19 (1H,ddd,J = 2.8,2.8,2.8 Hz,H-11),3.39 (1H,dd,J = 14.4,3.6 Hz,H-1a),3.30 (1H,dd,J = 12.8,4.0 Hz,H-9a),3.22 (1H,dd,J = 11.6,2.4 Hz,H-4),2.75 (1H,dd,J = 16.4,6.8 Hz,H-6a),2.65 (1H,dd,J = 13.2,4.0 Hz,H-14a),2.57 (1H,dd,J = 14.8,4.4 Hz,H-1b),2.50 (1H,m,H-9b),2.26 (1H,s,H-7),2.20 (1H,d,J = 16.8 Hz,H-6b),2.08 (2H,m,H-3a,10a),2.04 (3H,s,OCCH3),1.98～1.94 (2H,m,H-10b,2a),1.86 (1H,m,H-12),1.66 (1H,brd,J = 12.8 Hz,H-8a),1.59 (1H,ddd,J = 13.6,13.6,4.4 Hz,H-3b),1.49～1.40 (2H,m,H-15,2b),1.32 (1H,ddd,J = 12.4,12.4,2.8 Hz,H-8b),0.93 (1H,dd,J = 12.8,12.8 Hz,H-14b),0.84 (3H,d,J = 6.4 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 2。以上数据与文献报道一致[ 11 ]，故鉴定化合物2为acetyl- lycoposerramine-M。

表 2 化合物2、3、5～10的13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据 Table 2 13C-NMR (100 MHz,CDCl3) data of compounds 2,3,5—10

化合物3：无色晶体（甲醇）。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 3.41 (1H,dd,J = 14.0,3.6 Hz,H-1a),3.18 (1H,dd,J = 11.6,2.4 Hz,H-9a),2.85 (1H,dd,J = 11.6,2.4 Hz,H-9b),2.71 (1H,brd,J = 12.0 Hz,H-1b),2.55 (1H,dt,J = 16.4,6.0 Hz,H-6a),2.20 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-6b),0.84 (1H,d,J = 6.0 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 2。以上数据与文献报道一致[ 12 ]，故鉴定化合物3为石松碱。

化合物4：无色固体。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) 和13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 1。以上数据与文献报道一致[ 10 ]，故鉴定化合物4为lycoposerramine-M。

化合物5：无色晶体（甲醇）。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 4.01 (1H,dd,J = 12.0,2.8 Hz,H-8),3.87 (1H,t,J = 3.2 Hz,H-4),3.74 (1H,td,J = 12.8,2.4 Hz,H-9a),3.42 (1H,dt,J = 13.2,4.0 Hz,H-1a),3.14 (1H,dd,J = 16.4,5.6 Hz,H-6a),3.06 (1H,m,H-3a),2.91 (1H,dd,J = 12.8,3.6 Hz,H-9b),2.67 (1H,dd,J = 12.4,4.4 Hz,H-1b),2.37～2.15 (4H,m,H-2a,7,11a,14a),2.11 (1H,d,J = 14.4 Hz,H-10a),2.01 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-6b),1.88 (1H,dd,J = 12.0,3.6 Hz,H-11b),1.63 (1H,d,J = 14.0 Hz,H-2b),1.53～1.49 (3H,m,H-3b,10b,15),1.42 (1H,dd,J = 12.4,5.2 Hz,H-14b),0.79 (3H,d,J = 6.0 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 2。以上数据与文献报道一致[ 13 ]，故鉴定化合物5为miyoshianine-C。

化合物6：无色晶体（甲醇）。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 4.06 (1H,td,J = 12.4,3.2 Hz,H-9a),3.62 (1H,td,J = 13.6,4.4 Hz,H-1a),3.05～2.95 (2H,m,H-9b,10a),2.92 (1H,dd,J = 14.0,4.8 Hz,H-1b),2.84 (1H,dd,J = 12.0,2.8 Hz,H-4),2.74 (1H,t,J = 13.2 Hz,H-14a),2.61 (1H,dd,J = 17.2,6.0 Hz,H-6a),2.42 (1H,dd,J = 17.2,1.6 Hz,H-6b),2.23 (1H,td,J = 13.2,4.4 Hz,H-11a),2.17 (1H,m,H-3a),2.07 (1H,m,H-8a),2.04 (1H,brs,H-7),1.88～1.66 (5H,m,H-2a,2b,3b,10b,14b),1.63 (1H,dd,J = 13.6,4.8 Hz,H-11b),1.31～1.21 (2H,m,H-8b,15),0.93 (3H,d,J = 6.0 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 2。以上数据与文献报道一致[ 14 ]，故鉴定化合物6为12-epilycodoline N-oxide。

化合物7：黄色油状物。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 5.68 (1H,t,J = 3.6 Hz,H-11),3.32 (1H,dd,J = 10.0,4.4 Hz,H-8),3.02 (1H,td,J = 13.2,4.0 Hz,H-1a),2.97 (1H,m,H-9a),2.82～2.78 (2H,m,H-6a,7),2.71～2.58 (3H,m,H-1b,4,9b),2.38～2.26 (4H,m,H-6b,10a,10b,14a),1.69 (1H,m,H-2a),1.57～1.49 (2H,m,H-2b,3a),1.34 (1H,m,H-15),1.18 (1H,t,J = 13.6 Hz,H-14b),0.95 (3H,d,J = 6.0 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 2。以上数据与文献报道一致[ 15 ]，故鉴定化合物7为gnidioidine。

化合物8：无色粉末。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 5.70 (1H,dd,J = 4.0,4.0 Hz,H-11),3.82 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-6),3.08 (1H,dd,J = 12.8,2.8 Hz,H-1a),3.01 (1H,dd,J = 12.0,2.4 Hz,H-4),2.87 (1H,m,H-9a),2.73 (1H,dd,J = 11.2,5.6 Hz,H-9b),2.68 (1H,m,H-7),2.62 (1H,dd,J = 12.8,2.8 Hz,H-1b),2.36 (1H,dd,J = 13.2,4.0 Hz,H-14a),1.96 (1H,brd,J = 12.0 Hz,H-3a),1.81 (1H,m,H-8a),1.69～1.42 (4H,m,H-2a,2b,3b,15),1.32 (1H,ddd,J = 13.2,13.2,4.8 Hz,H-8b),1.13 (1H,t,J = 12.8 Hz,H-14b),0.82 (3H,d,J = 6.0 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 2。以上数据与文献报道一致[ 10 ]，故鉴定化合物8为lycoposerramine-K。

化合物9：无色针晶（甲醇）。1H-NMR (400 MHz,DMSO) δ: 5.23 (1H,dd,J = 4.0,2.8 Hz,H-11),4.82 (1H,d,J = 4.0 Hz,5-OH),4.30 (1H,d,J = 3.2 Hz,6-OH),3.51 (1H,brs,H-5),3.48 (1H,dd,J = 5.6,5.6 Hz,H-6),3.01 (1H,dddd,J = 11.6,11.6,5.6,5.6 Hz,H-15),2.90 (1H,ddd,J = 12.0,12.0,2.8 Hz,H-1a),2.60～2.53 (2H,m,H-9a,9b),2.40 (1H,dd,J = 12.0,2.4 Hz,H-1b),2.25 (1H,dd,J = 4.4,2.0 Hz,H-7),2.14～2.07 (2H,m,H-10a,14a),1.94～1.82 (2H,m,H-4,10b),1.74 (1H,dd,J = 12.4,5.6 Hz,H-8a),1.62～1.55 (2H,m,H-2a,3a),1.50 (1H,m,H-2b),1.30 (1H,dd,J = 12.4,2.4 Hz,H-3b),1.07 (1H,ddd,J = 12.4,5.6,5.6 Hz,H-8b),0.92 (1H,t,J = 12.4 Hz,H-14b),0.76 (3H,d,J = 6.8 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,DMSO) 数据见表 2。以上数据与文献报道一致[ 10 ]，故鉴定化合物9为光泽石松灵碱。

化合物10：无色晶体（氯仿）。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 5.65 (1H,d,J = 6.0 Hz,H-11),3.14 (1H,dd,J = 15.2,7.2 Hz,H-6a),2.85 (1H,td,J = 14.0,2.4 Hz,H-1a),2.76 (2H,m,H-7,9a),2.55 (1H,dd,J = 12.0,6.4 Hz,H-9b),2.41 (2H,m,H-1b,10a),2.27 (1H,d,J = 14.8 Hz,H-6b),2.13 (1H,dd,J = 13.2,4.0 Hz,H-14a),1.93～1.84 (4H,m,H-2a,3a,8a,10b),1.70～1.60 (3H,m,H-2b,3b,15),1.28～1.25 (2H,m,H-8b,14b),0.85 (3H,d,J = 6.4 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 2。以上数据与文献报道一致[ 16 ]，故鉴定化合物10为4α-hydroxyanhydrolycodoline。

化合物11：淡黄色粉末。该化合物最初在1963年被分离得到[ 17 ]，但查阅相关文献均未发现其波谱数据报道，通过解析其一维和二维核磁谱，对其数据进行归属。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 6.24 (1H,s,NH),3.51 (1H,dd,J = 13.2,3.6 Hz,H-1a),3.04 (1H,dd,J = 13.6,3.6 Hz,H-9a),2.75～2.65 (2H,m,H-1b,9b),2.58 (1H,dd,J = 16.8,4.4 Hz,H-6a),2.46 (1H,brd,J = 10.0 Hz,H-3a),2.34 (1H,dd,J = 12.4,4.0 Hz,H-14a),2.01 (3H,s,OCCH3),1.98～1.90 (3H,m,H-2a,3b,7),1.86 (2H,m,H-6b,10a),1.79～1.66 (4H,m,H-2b,10b,12,15),1.62～1.54 (3H,m,H-8a,11a,11b),1.31～1.25 (2H,m,H-8b,14b),0.88 (3H,d,J = 6.4 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 3。由以上数据确定化合物11结构，鉴定为flabelline。

表 3 化合物11～19的13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据 Table 3 13C-NMR (100 MHz,CDCl3) data of compounds 11—19

化合物12：无色固体。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.76 (1H,d,J = 8.0 Hz,H-3),6.96 (1H,d,J = 8.0 Hz,H-2),4.21 (1H,ddq,J = 8.8,6.4,2.8 Hz,H-18),3.11 (1H,dd,J = 18.8,7.2 Hz,H-6a),2.84～2.75 (3H,m,H-17a,17b,9a),2.67 (1H,d,J = 18.8 Hz,H-6b),2.48 (1H,ddd,J = 13.2,13.2,2.4 Hz,H-9b),2.07 (1H,m,H-7),1.76 (1H,brd,J = 12.4 Hz,H-8a),1.60～1.45 (4H,m,H-10a,10b,12,14a),1.32 (1H,dd,J = 12.8,3.6 Hz,H-8b),1.26 (3H,d,J = 6.0 Hz,19-CH3),1.22～1.18 (4H,m,H-11a,11b,14b,15),0.77 (3H,d,J = 5.2 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 3。以上数据与文献报道一致[ 18 ]，故鉴定化合物12为hydroxypropyllycodine。

化合物13：无色针晶（甲醇）。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 8.40 (1H,dd,J = 4.8,1.6 Hz,H-1),7.96 (1H,d,J = 6.8 Hz,H-3),7.18 (1H,dd,J = 7.6,4.8 Hz,H-2),3.18 (1H,dd,J = 18.8,7.2 Hz,H-6a),2.97 (1H,m,H-9a),2.74 (1H,d,J = 18.8 Hz,H-6b),2.52 (1H,m,H-9b),0.78 (3H,d,J = 6.0 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 3。以上数据与文献报道一致[ 12 ]，故鉴定化合物13为石松定碱。

化合物14：无色晶体（甲醇）。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.83 (1H,s,NH),2.83 (1H,dt,J = 12.4,3.2 Hz,H-9a),2.47～2.31 (5H,m,H-2a,2b,3a,3b,9b),0.83 (3H,d,J = 6.0 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 3。以上数据与文献报道一致[ 18 ]，故鉴定化合物14为去-N-甲基-α-玉柏碱。

化合物15：无色粉末。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 2.73～2.59 (2H,m,H-9a,9b),2.43 (3H,s,N-CH3),2.41 (4H,m,H-2a,2b,3a,3b),0.85 (3H,d,J = 6.4 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 3。以上数据与文献报道一致[ 12 ]，故鉴定化合物15为α-玉柏碱。

化合物16：白色粉末。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.64 (1H,d,J = 9.2 Hz,H-3),6.46 (1H,d,J = 9.2 Hz,H-2),2.95 (1H,dd,J = 18.8,7.2 Hz,H-6a),2.84 (1H,d,J = 12.4 Hz,H-9a),2.43～2.39 (2H,m,H-6b,9b),2.05 (1H,m,H-7),1.71 (1H,brd,J = 12.8 Hz,H-8a),1.57～1.45 (5H,m,H-10a,10b,12,14a,15),1.31～1.22 (3H,m,H-8b,11a,11b),1.11 (1H,m,H-14b),0.81 (3H,d,J = 6.4 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 3。以上数据与文献报道一致[ 18 ]，故鉴定化合物16为去-N-甲基- β-玉柏碱。

化合物17：无色油状物。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 3.18 (1H,brd,J = 14.8 Hz,H-17a),3.12 (1H,ddd,J = 12.0,6.0,2.4 Hz,H-9a),2.96 (1H,dd,J = 12.8,4.0 Hz,H-1a),2.81 (2H,m,H-1b,9b),2.63 (1H,m,H-6a),2.38 (1H,dd,J = 18.8,8.8 Hz,H-6b),1.01 (3H,d,J = 6.4 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 3。以上数据与文献报道一致[ 19 ]，故鉴定化合物17为石松佛利星碱。

化合物18：无色固体。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 3.70 (4H,m,H-1a,9a,9b,17a),3.35 (1H,ddd,J = 12.4,12.4,2.8 Hz,H-1b),3.05 (1H,d,J = 14.0 Hz,H-17b),2.72 (1H,m,H-7),2.41 (1H,dd,J = 18.4,7.6 Hz,H-6a),2.32 (2H,m,H-14a,14b),2.26～2.07 (7H,m,H-2a,3a,6b,10a,11a,11b,15),2.03～1.92 (3H,m,H-2b,3b,10b),1.85 (1H,m,H-8a),1.74 (1H,ddd,J = 14.8,12.0,4.4 Hz,H-8b),1.04 (3H,d,J = 6.4 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 3。以上数据与文献报道一致[ 20 ]，故鉴定化合物18为lycoflexine N-oxide。

化合物19：白色粉末。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 5.71 (1H,d,J = 4.0 Hz,H-14),2.74 (1H,dd,J = 16.4,7.2 Hz,H-6a),1.03 (3H,d,J = 6.8 Hz,16-CH3)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 数据见表 3。以上数据与文献报道一致[ 21 ]，故鉴定化合物19为法氏石松定碱。 3.2 抗炎活性

NO作为炎症组织损伤的重要致病因子，是由一氧化氮合酶（iNOS）催化而成，为了评价19个化合物的抗炎活性，检测了化合物干预LPS活化的RAW264.7细胞培养液上清中NO的量，化合物的浓度为6.25～50 μmol/L。19个化合物中5和18表现出良好的NO抑制活性（图 2），其IC50分别为（31.82±3.74）、（40.69±5.78）μmol/L。

与正常组比较：###P < 0.001；与对照组比较：*P < 0.05 **P < 0.01
###P < 0.001 vs normal group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs control group图 2 化合物5 (a) 和18 (b) 对LPS活化的RAW264.7细胞释放NO的影响Fig. 2 Effects of compounds 5 (a) and 18 (b) on release of NO in LPS-activated RAW 264.7 cells
4 讨论

石松为蕨类植物，石松生物碱Lycopodium alkaloids是从石松及其近缘植物中分得的结构相似，具有相同生源的一类天然生物碱，自20世纪80年代初刘嘉森等[ 22 ]从蛇足石杉中分离出一种高效低毒、可逆并选择性抑制乙酰胆碱酯酶的石杉碱甲以来，这类生物碱已引起了国内外科学家浓厚的兴趣。国外学者还发现石松总生物碱具有显著的抗炎活性，但对单体生物碱的抗炎活性并没有报道[ 8 ]。2013年，国内学者报道了几种石松生物碱可以一定程度抑制LPS诱导的BV2细胞中NO释放，其IC50均小于50 μmol/L，其中活性最好化合物α-lofoline的IC50为4.23 μmol/L，但未进一步对其作用机制进行研究[ 23 ]。本实验以LPS诱导RAW264.7细胞建立细胞炎症模型，采用Griess法检测NO量评价了从石松全草中分离得到的19个石松生物碱的抗炎活性，但只有化合物5和18具有一定的抗炎活性，IC50分别为31.82和40.69 μmol/L，同总生物碱相比其抗炎活性较差，因而推测石松生物碱发挥抗炎活性，有可能通过协同的作用机制，其抗炎机制有待以后进一步阐明，本研究为进一步开发和利用石松奠定了基础。

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