致死性室性心律失常是急性心肌梗死后严重并发症之一，炎症细胞因子在急性心肌梗死后室性心律失常发生过程中发挥了重要作用^{[ 1 ]}。麝香保心丸具有扩张冠状动脉、促进梗死周围区缺血心肌新生血管形成、防治心肌梗死后心室重构的作用^{[ 2 ]}，近年研究发现麝香保心丸对冠心病合并心律失常亦有治疗作用^{[ 3 ]}，但未见其作用于急性心肌梗死后心律失常的报道。本研究选择急性心肌梗死大鼠为研究对象，观察麝香保心丸对不同时间点梗死边缘带心肌组织中炎症细胞因子白细胞介素-18（IL-18）表达以及室性心律失常诱发率的影响，探讨麝香保心丸对急性心肌梗死后室性心律失常的作用及机制。 1 材料 1.1 药物与试剂

麝香保心丸（22.5 mg/丸），上海和黄药业有限公司产品，批号101209。兔抗大鼠IL-18单克隆抗体、过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体、FITC标记的山羊抗兔IgG、BCA蛋白定量试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。ECL试剂盒购自美国Pierce公司。 1.2 实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠，体质量（250±30）g，购自华中科技大学同济医学院动物实验中心，动物许可证号SCXK（鄂）2010-0009。 1.3 仪器

BL-420F生物信号采集处理系统，成都泰盟科技有限公司；DYCZ-25D电泳仪，北京六一仪器厂；荧光激光共聚焦显微镜（LSCM），德国Leica公司。 2 方法 2.1 动物模型制备、分组与给药

按文献报道方法^{[ 4 ]}结扎大鼠左冠状动脉前降支制备大鼠急性心肌梗死模型，术后24 h存活90只大鼠，随机分为模型组和麝香保心丸高、低剂量（45.0、22.5 mg/kg^{[ 5 ]}）组，每组30只。每组大鼠依观察时间不同再分为第1、2周末2个亚组，每个亚组15只。麝香保心丸组第1、2周末2个亚组分别于术后第2天起ig给药1、2周。另设20只大鼠为假手术组，仅在左冠状动脉前降支穿线不结扎，术后分为第1、2周末2个亚组，每组10只。假手术组和模型组每日ig给予等量生理盐水。第1周末时模型组，麝香保心丸高、低剂量组，假手术组大鼠分别存活12、14、13、10只。第2周末时模型组，麝香保心丸高、低剂量组，假手术组大鼠分别存活10、13、11、10只。第1、2周末大鼠称质量后，ip 3%戊巴比妥30 mg/kg麻醉，迅速开胸，以程序电刺激诱发各组大鼠室性心律失常后取出心脏。假手术组取位于左心室游离壁心肌组织、心肌梗死各组取位于左心室梗死边缘带（以结扎线为标志，梗死苍白区边缘至边缘3 mm以内），心肌组织保存待检。 2.2 程序电刺激诱发各组大鼠室性心律失常变化

大鼠腹腔麻醉后固定、气管插管。连接肢体导联心电图后于左前胸第3、4肋间开胸，暴露心脏，以双极针形电极刺入左室心尖部作为刺激电极，进行程序电刺激诱发室性心律失常并同步记录心电图，电生理参数采用BL-420F生物信号采集与处理系统记录^{[ 6 ]}。程序电刺激S1S2周长为100 ms，波宽2 ms，电压5 mV，脉冲数为8个；S2强度为5 mV，波宽为2 ms，脉冲数为1个，步长为−2 ms，直至S2后不再出现R2，即不应期或诱发出室性心律失常。如果未能诱发室性心律失常，将S1S2间期设为不应期加10 ms，并加用期前刺激S3，以2 ms递减刺激直到不应期或诱发出室性心律失常。此处室性心律失常特指连续出现6个及6个以上宽QRS波的室性心动过速（室速）或者心室颤动（室颤）。 2.3 LSCM观察各组大鼠心肌组织IL-18表达

取各组大鼠部分心肌组织制备10 μm厚的冰冻切片，组织切片与心肌纵轴平行，经固定、洗脱后以1∶100兔抗大鼠IL-18单克隆一抗孵育过夜，再予1∶100 FITC标记的山羊抗兔IgG常温孵育2 h，封片后即在LSCM下观察，FITC激发波长为492 nm，发射波长为520 nm，每张切片取4～6个视野，选择细胞纵行走向区域进行观察。 2.4 Western blotting检测各组心肌组织IL-18表达

取大鼠部分心肌组织100 mg，匀浆后加入适量组织蛋白裂解液，离心后吸取上清，按照BCA蛋白定量试剂盒说明进行蛋白定量测定。在电泳仪上用等量蛋白质样品经15% SDS-PAGE分离后，转移于硝酸纤维素膜（PVDF）上。以1∶1 000的兔抗大鼠IL-18单克隆一抗4 ℃静置孵育过夜，再以1∶10 000过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h，在暗室用ECL试剂盒发光显影，同时检测GAPDH的表达作为内参对照。图片经光密度图像扫描仪扫描，以Quantity One软件对结果进行分析，检测各组大鼠心肌组织IL-18与GAPDH表达灰度的比值。

2.5 统计学处理

计量资料以x±s表示，采用SAS软件行方差分析，两组均数间的比较采用t检验，率的比较采用χ²检验。

3 结果 3.1 大鼠心律失常诱发结果

第1、2周末时模型组室性心律失常诱发率均高于假手术组（P＜0.01）。麝香保心丸低剂量组第2周末时室性心律失常诱发率显著低于模型组（P＜0.05），而第1周末时则无显著差异。第1、2周末麝香保心丸高剂量组室性心律失常诱发率显著低于模型组（P＜0.01）。麝香保心丸高剂量组室性心律失常诱发率在第1周末（P＜0.01）、第2周末（P＜0.05）时均显著低于低剂量组，见图 1和表 1。

A-室速 B-室颤 A-ventricular heartbeat tachycardia B-ventricular fibrillation图 1 程序电刺激诱发室性心律失常Fig. 1 Ventricular arrhythmia induced by programmed electrical stimulus

表 1(Table 1)

表 1 第1、2周末时麝香保心丸对急性心肌梗死大鼠室性心律失常诱发率的影响 Table 1 Effect of SBP on ventricular arrhythmia inducibility in rats at 1st and 2nd weekendsafter acute myocardial infarction 组别 剂量/(mg∙kg−1) 时间 动物/只 诱发率/% 假手术 — 第1周末 10 0.00** — 第2周末 10 0.00** 模型 — 第1周末 12 91.67 — 第2周末 10 60.00∆ 麝香保心丸 45.0 第1周末 14 42.86**## 第2周末 13 30.77**#∆ 22.5 第1周末 13 92.31 第2周末 11 45.46*∆ 同一时间点时，与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与麝香保心丸低剂量组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；同一组内，与第1周末比较：∆P＜0.05 *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group at same time point,#P < 0.05 ##P < 0.01 vs low dose SBP group; ∆P < 0.05 vs 1st weekend in same group

表 1 第1、2周末时麝香保心丸对急性心肌梗死大鼠室性心律失常诱发率的影响 Table 1 Effect of SBP on ventricular arrhythmia inducibility in rats at 1st and 2nd weekendsafter acute myocardial infarction

第1、2周末时模型组和高、低剂量麝香保心丸组IL-18表达主要在心肌间质，少量分布于心肌细胞内。第1、2周末时假手术组仅细胞间质有微弱IL-18表达，见图 2。

图 2 LSCM观察急性心肌梗死第1周末 (A) 和第2周末 (B) 时各组大鼠梗死边缘带心肌组织中IL-18的表达 Fig. 2 Expression of myocardial IL-18 in border zone myocardium of rats in each group at 1st weekend (A) and 2nd weekend (B) after acute myocardial infarction by immunofluorescence LSCM

第1、2周末时模型组大鼠梗死边缘带心肌组织中IL-18表达水平均高于假手术组（P＜0.01）。麝香保心丸低剂量组第2周末时边缘带心肌组织IL-18表达水平显著低于模型组（P＜0.05），而第1周末时则无显著差异。麝香保心丸高剂量组第1、2周末边缘带心肌组织IL-18表达水平显著低于模型组（P＜0.01）。麝香保心丸高剂量组边缘带心肌组织IL-18表达水平在第1周末（P＜0.01）、第2周末（P＜0.05）时均显著低于低剂量组，见图 3和表 2。

图 3 LSCM急性心肌梗死第1周末 (A) 和第2周末 (B) 各组大鼠梗死边缘带心肌组织中IL-18蛋白表达 Fig. 3 Expression of myocardial IL-18 in border zone myocardium of rats in each group at 1st weekend (A) and 2nd weekend (B) after acute myocardial infarction

表 2(Table 2)

表 2 麝香保心丸对急性心肌梗死后第1、2周末大鼠梗死边缘带心肌组织IL-18蛋白表达的影响(x±s Table 2 Effect of SBP on expression of IL-18 in border zone myocardium in rats at 1st weekend and 2nd weekend after acute myocardial infarction(x±s) 组别 剂量/(mg∙kg−1) 时间 动物/只 IL-18 假手术 — 第1周末 10 0.040±0.003** 第2周末 10 0.038±0.002** 模型 — 第1周末 12 0.318±0.025 第2周末 10 0.208±0.014∆ 麝香保心丸 45.0 第1周末 14 0.107±0.030**## 第2周末 13 0.058±0.021**#∆ 22.5 第1周末 13 0.297±0.031 第2周末 11 0.108±0.022*∆ 同一时间点时，与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与低剂量麝香保心丸组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；同一组内，与第1周末比较：∆P＜0.05 *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group at same time point,#P < 0.05 ##P < 0.01 vs low-dose SBP group; ∆P < 0.05 vs 1st weekend in same group

表 2 麝香保心丸对急性心肌梗死后第1、2周末大鼠梗死边缘带心肌组织IL-18蛋白表达的影响(x±s) Table 2 Effect of SBP on expression of IL-18 in border zone myocardium in rats at 1st weekend and 2nd weekend after acute myocardial infarction(x±s)

冠状动脉阻塞后形成的心肌梗死区周围往往存在一层功能异常但尚未坏死的心肌，即所谓边缘带或边缘层。随着梗死时间的延长，边缘带不断向外扩展，在各种因素的综合作用下形成特殊的心肌病理状态。边缘带心肌病理生理状态与急性心肌梗死后出现的心律失常等密切相关^{[ 7 ]}。心肌梗死后周围边缘带出现交感神经再生，交感神经密度和活性的增加，导致动作电位时程（APD）延长和细胞间APD的异步性，增加发生室速、室颤等严重心律失常的可能性^{[ 8 ]}。边缘带中的细胞离子通道异常也是心律失常发生的重要原因之一。边缘带钠离子通道功能发生改变、快钠电流密度降低、失活后恢复缓慢，导致心肌兴奋性和传导性异常，极易出现室性心律失常。

IL-18是一种多效能的致炎细胞因子，其可诱导产生γ干扰素（IFN-γ），通过激活单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞而促发炎症反应，在TH1型免疫应答中发挥重要作用。研究发现IL-18水平在急性心肌梗死时显著升高^{[ 9 ]}。IL-18增高的冠心病患者致命性心血管事件（如致命性室性心律失常等）发生率明显高于低IL-18水平者，其对冠心病死亡的预测价值大于其他炎性标志物^{[ 10 ]}，是预测缺血性心脏病并发心律失常的独立危险因素^{[ 11 ]}。

本研究发现急性心肌梗死后第1、2周末时各组心肌梗死大鼠室性心律失常的诱发率均随边缘带心肌组织中IL-18表达增高而升高，表明急性心肌梗死后早期室性心律失常的发生与边缘带心肌中IL-18表达升高密切相关。各组心肌梗死大鼠第2周末均较第1周时IL-18表达明显下降，室性心律失常的诱发率亦随之下降，表明急性心肌梗死后IL-18表达及室性心律失常诱发率随时间延长而呈下降趋势，亦从侧面反映出急性心肌梗死后早期边缘带IL-18表达快速、明显地升高在室性心律失常发生过程中发挥重要作用。第1周时只有麝香保心丸高剂量组能降低IL-18表达及室性心律失常的诱发率而低剂量组无此作用，推测早期大剂量应用麝香保心丸可使血药浓度快速达到足以抑制IL-18等炎性细胞因子过度表达的稳态水平，进而降低室性心律失常的诱发率。随着时间延长，第2周末时麝香保心丸低剂量亦能降低IL-18表达水平及室性心律失常诱发率，推测通过较长时间的低剂量麝香保心丸治疗亦能使血药浓度达到抑制IL-18等炎性细胞因子过度表达的稳态水平，但与高剂量组比较，其边缘带心肌IL-18表达及室性心律失常诱发率的下降程度明显偏低，表明麝香保心丸降低急性心肌梗死后室性心律失常诱发率的作用与抑制边缘带心肌IL-18过度表达有关，其作用呈剂量相关性。

综上所述，急性心肌梗死后边缘带心肌IL-18表达水平随时间延长而呈下降趋势，急性心肌梗死后早期大剂量应用麝香保心丸能更有效抑制炎性细胞因子IL-18的过度表达，更有助于防治室性心律失常的发生。随着其抑制急性心肌梗死后心肌炎症反应作用及其机制的研究不断丰富，麝香保心丸有望进一步地应用于急性心肌梗死后心律失常的治疗。