近年来，抗生素因耐药性、药物残留等问题使其应用受到限制，银纳米颗粒因良好的抗菌性能，已应用于导尿管等各种医疗器材及抗菌织物等的抗感染，目前对其研究日趋活跃^[1]。制备银纳米颗粒的方法有物理法、化学法和生物法等。物理、化学法因成本、污染等原因其应用受限^{[2, 3]}；植物生物还原法，具有成本低、能耗低、污染小等优点，可获得稳定性较高的银纳米颗粒^[4]。植物生物还原法自Gardea-Torresdey^[5]采用紫花苜蓿研究制备银纳米颗粒以来，至今已筛选出天竺葵^[6]、芳樟^[7]等多种植物用于制备银纳米颗粒。

中药材属于典型的植物资源，现代研究发现，中药材中多羟基类化合物在金属纳米材料的还原过程中起主导作用，其在还原制备金属纳米颗粒方面具有广阔的发展前景^[8]。由于采用的材料为中药材，所得的银纳米颗粒具有更好的生物相容性^[9]，更适于临床应用。但有关中药材生物质还原法制备银纳米颗粒及其抗菌活性研究国内外少有报道。

本研究选择不同功效、不同药用部位的15种中药材，利用中药材提取液来还原Ag⁺获得相应的银纳米抗菌颗粒材料。通过对中药材的筛选，以及中药材还原过程的工艺路线的优化，进一步探讨中药材银纳米颗粒的抗菌活性，为具有中药材生物活性特性的新型银纳米抗菌颗粒的开发提供理论基础。

UV-2600A型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；HANGPING FA1104型电子天平，上海仪器厂；TecnaiG220型透射电镜，美国FEI公司；Mastersizer 2000激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司。硝酸银，批号20071009，质量分数＞98%，购于上海试剂一厂；其他试剂均为分析纯。

实验所用中药材（大黄Rhei Radix et Rhizoma、制首乌Polygoni Multiflori Radix Praeparata、金银花Lonicerae Japonicae Flos、连翘Forsythiae Fructus、黄连Coptidis Rhizoma、香薷Moslae Herba、筋骨草AjugaeHerba、桂枝Cinnamomi Ramulus、银杏叶Ginkgo Folium、银耳Tremella fuciformis、灵芝Ganoderma lucidum、玄参Scrophulariae Radix、山楂Crataegi Fructus、厚朴Magnolia Officinalis Cortex、紫苏叶Perillae Folium）均经浙江中医药大学资源鉴定教研室俞冰副教授鉴定为正品。供试菌种大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus均由浙江中医药大学生物工程学院微生物实验室提供。

取干燥药材粉末（粉碎机粉碎）10 g，加500 mL去离子水或95%乙醇浸泡30 min，沸水浴回流提取1.0 h，减压抽滤，临用前取滤液适量，4 000 r/min离心20 min，取上清液，作为供试品溶液，备用。

取1mL中药材水提或醇提供试品溶液，加入0.01 mol/L的银氨溶液4 mL，37 ℃加热至液体颜色加深，反应6 h后4 ℃放置12 h，4 000 r/min离心20 min，取上清液；于上清液中加入0.1 mol/L的稀盐酸溶液，观察AgCl的生成量。评分方法：（1）反应速率：1～2 h内反应完全为“++++”，2～3 h内反应完全为“+++”，3～4 h内反应完全为“++”，4～5 h内反应完全为“+”，5～6 h内反应完全为“0”；（2）反应得率：无AgCl白色沉淀为“+++”，微乳白色为“++”，少量白色沉淀为“+”，大量白色沉淀为“0”；（3）纳米颗粒品质：管壁无银镜附着为“+++”，管壁少量银镜附着为“++”，管壁大量银镜附着为“+”，管底黑色大颗粒沉淀为“0”。结果见表 1。

结果表明，各中药材醇提液反应得率、反应速率均不及水提液，仅是纳米颗粒品质稍好于水提液，考虑到实际生产过程中乙醇成本及醇提工艺操作的安全性，综合考虑优选去离子水作为提取溶剂。经观察比较，大黄、制首乌、香薷水提液所形成的银纳米溶液在反应速率、反应得率和纳米颗粒品质3个指标方面总体优于其他中药材提取物（表 1）；且溶液外观较厚朴、银杏等纳米溶液更澄清透明（图 1），因此本研究选择大黄、制首乌、香薷供进一步实验。

取5～10 mL制备的纳米银溶液在激光粒度仪（HPPS）的测试皿中于25 ℃下测试。结果如图 2所示，大黄-银纳米颗粒、香薷-银纳米颗粒、制首乌-银纳米颗粒的粒径分别为106.4、140.7、77.67 nm。

取一定量大黄、制首乌、香薷-银纳米溶液，滴加于一面覆有碳膜的铜网上，铜网自然晾干2 h后，用TEM在加速电压为200 kV，点分辨率0.24 nm，线分辨率0.14 nm条件下观察（图 3）。由图 3可知，大黄、制首乌、香薷还原制得的纳米银颗粒近球形，粒径在100 nm左右，该结果与HPPS测定结果一致，且均匀性、分散性好，说明大黄、制首乌、香薷中可能既有可将银离子还原成单质的还原性物质，同时还含有稳定性物质。

表 1(Table 1)

表 1 15种中药材提取液反应速率及反应得率的比较 Table 1 Comparison on reaction rate and yield in 15 kinds of herbs 批号 供试品 (水提液) 反应速率 反应得率 纳米颗粒品质 批号 供试品 (醇提液) 反应速率 反应得率 纳米颗粒品质 90806 大黄 ++++ ++++ +++ 90806 大黄 + + +++ 100918 制首乌 ++++ ++++ +++ 100918 制首乌 + + +++ 90623 金银花 ++++ ++++ ++ 90623 金银花 + 0 ++ 90506 连翘 +++ ++++ + 90506 连翘 + 0 ++ 80112 黄连 ++ ++++ 0 80112 黄连 + 0 ++ 80711 香薷 ++++ ++++ +++ 80711 香薷 + + +++ 100413 筋骨草 0 ++++ + 100413 筋骨草 + 0 ++ 90423 桂枝 0 ++++ +++ 90423 桂枝 + 0 ++ 101126 银杏 ++++ ++++ ++ 101126 银杏 + 0 ++ 90626 银耳 +++ ++++ +++ 90626 银耳 + 0 ++ 101009 灵芝 ++ ++++ + 101009 灵芝 + 0 ++ 100726 玄参 ++++ 0 0 100726 玄参 + 0 ++ 100114 山楂 0 + +++ 100114 山楂 + 0 ++ 100926 厚朴 ++ + + 100926 厚朴 + 0 ++ 90914 紫苏 +++ ++++ +++ 90914 紫苏 + 0 +++

表 1 15种中药材提取液反应速率及反应得率的比较 Table 1 Comparison on reaction rate and yield in 15 kinds of herbs

A-大黄-银纳米溶液 B-厚朴-银纳米溶液 C-银杏-银纳米溶液 D-制首乌-银纳米溶液 E-香薷-银纳米溶液 F-空白 A-Rhei Radix et Rhizoma-silver nano solution B-Magnolia Officinalis Cortex-silver nano solution C-Ginkgo Folium-silver nano solution D-Polygoni Multiflori Radix Praeparata-silver nano solution E-Moslae Herba-silver nano solution F-blank 图 1 银纳米溶液外观特征Fig.1 Appearance feature of silver nano solution

图 2 银纳米颗粒的激光粒度分析Fig.2 Analysis of laser particle size of silver nanoparticles

图 3 银纳米颗粒的TEM照片Fig.3 TEM photographs of silver nanoparticles

取1 mL大黄、制首乌、香薷供试品水提液，加入0.01 mol/L的银氨溶液4 mL，37 ℃水浴加热，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h取0.1 mL反应溶液，加去离子水4 mL，分别于分光光度计210～600 nm波长下扫描（图 4），同时以不加中药材水提液做一空白对照，随行实验。由图 4可知，不同时间点尤其在1 h后扫描的紫外-可见吸收光谱峰形基本一致，说明在1 h之后，纳米颗粒基本形成，且在4 h内，大黄、制首乌、香薷还原制备的纳米材料具有良好的稳定性。

图 4 银纳米颗粒的紫外-可见光谱Fig.4 UV-visible spectrum of silver nanoparticles

2.4 抑菌活性实验 2.4.1 菌悬液的制备

将测试用细菌E. coli、S. aureus分别接种于无菌的牛肉膏蛋白胨培养基（NA）上，在35 ℃下培养24 h，挑取少许活化的菌体置于生理盐水试管中，摇匀，配制成1×10⁶～1×10⁷ CFU/mL的菌悬液。

采用2倍稀释法测定MIC^[10]。中药材-银纳米供试品溶液（生药量4 mg/mL）、银氨溶液、普通银纳米溶液（含有8 mmol/L的银离子），为便于比较抑菌强弱，中药材溶液质量浓度（生药量4 mg/mL）按含等浓度中药材的中药材-银纳米溶液计相当于8 mmol/L；而阳性对照药卡那霉素用无菌水配成0.34 mmol/L的溶液。将待测溶液和阳性对照溶液分别在96孔板上连续稀释2倍配成一系列的浓度梯度，每孔含50 μL溶液。每孔中加入50 μL预先培养的菌悬液，每个样品重复3次，随行无菌水阴性对照及细菌对照。将96孔板在28 ℃下培养，待培养24 h后观察。MIC结果判断：以不产生浑浊的最低浓度孔对应的浓度作为该样品对该菌的MIC。结果见表 2。

获取MIC结果后，将MIC孔、2×MIC孔、4×MIC孔、8×MIC孔4个孔中的培养物各吸取10 μL，接种到新鲜的NA培养液中（0.2 mL/孔），每个样品重复3次，随行无菌水阴性对照和细菌对照，置于37 ℃培养箱中培养48 h，观察结果。MBC结果判断：以细菌生长阴性孔对应的浓度为MBC。结果见表 2。

由表 2结果可知，中药材-银纳米颗粒具有较强的抑菌和杀菌作用，虽然抗菌活性远低于阳性对照卡那霉素，但显著强于普通银纳米颗粒（普通银纳米颗粒是以羧甲基纤维素钠作为还原剂制备的银纳米颗粒，制备方法同“2.2”项）及中药材溶液。其中，制首乌-银纳米颗粒作用最强，其MIC和MBC分别为0.125、0.250 mmol/L。

本研究首次利用大黄、制首乌、金银花等15种临床常用中药材提取物，还原制备银纳米颗粒，拓宽了中药材生物质的应用范围，证明了许多中药材（不同功效、不同药用部位）可用作新型的植物生物还原剂。利用中药材水提物在常温条件下制备银纳米颗粒材料，纳米颗粒呈现近球形，粒度均匀，稳定性好，分散度高。

所制得的银纳米颗粒对E. coli、S. aureus均有很强的抑制作用，这种抑制作用强于普通银纳米颗粒、银氨溶液及各个中药材单独应用时的效果，原因可能是中药材还原制备银纳米颗粒，中药材本身的抑菌效果与银纳米材料的抑菌效果产生了叠加效应，但为何是抑菌效果最差的制首乌制备的银纳米

表 2(Table 2)

表 2 中药材-银纳米溶液的抗菌活性结果 Table 2 Results of antibacterial activity in TCMM-silver nano solution 供试品 E. coli S. aureus MIC/(mmol∙L-1) MBC/(mmol∙L-1) MIC/(mmol∙L-1) MBC/(mmol∙L-1) 大黄-银纳米 0.250 0.50 0.50 1.00 制首乌-银纳米 0.125 0.25 0.25 0.25 香薷-银纳米 0.250 0.50 0.25 0.50 普通银纳米 1.000 1.00 1.00 1.00 银氨溶液 1.000 1.00 1.00 1.00 大黄溶液 2.000 4.00 2.00 4.00 制首乌溶液 4.000 8.00 4.00 8.00 香薷溶液 1.000 4.00 2.00 4.00 卡那霉素 1.33×10-3 2.66×10-3 2.66×10-3 2.66×10-3

表 2 中药材-银纳米溶液的抗菌活性结果 Table 2 Results of antibacterial activity in TCMM-silver nano solution

颗粒作用最强，是否由其粒径决定，具体机制有待深入研究。采用中药材所制得的银纳米颗粒相比普通化学还原制备的银纳米颗粒具有更好的生物相容性^[9]，更适合临床应用，因此在抗菌作用方面具有广阔的应用价值。