2015, Vol. 46
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.06.011 |
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药物研究所 药物制剂研究室, 北京 100050
2. Department of Pharmaceutics, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
香青兰Dracocephali Moldavici Herba为唇形科（Labiatae）青兰属Dracocephalum L. 植物香青兰Dracocephalum moldavica L. 的干燥地上部分[1]，性质二级干热，有很强的香味，具有补益心脑、活血化瘀、通路开窍、止痛解毒、利尿止咳之功能，在维吾尔医学和民间其用于治疗冠心病、血液质旺盛（高血压）、寒性神经性头疼、寒性感冒、气管炎等疾病。香青兰生长于海拔220～1 600 m的干燥山地、山谷、河滩多石处，我国资源十分丰富[2]，分布于新疆、吉林、辽宁、甘肃、青海及黑龙江。其主要含有黄酮类、三萜类、苯丙素类、甾体类、环烯醚萜类和多糖类等成分，其中，黄酮类和苯丙素类成分是其发挥药理作用的主要活性成分[3, 4]。黄酮类成分木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（I）、芹菜素- 7-O-葡萄糖醛酸苷（II）、香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷（III）、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷（IV）和田蓟苷既是香青兰中量较高的成分，也是扩张冠脉、降低冠脉血管阻力的主要活性成分[5, 6]；苯丙素类化合物迷迭香酸在香青兰中量较高[7, 8]，且文献报道其具有抗血栓、抗血小板凝集、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒和免疫调节的作用[9]。目前，关于香青兰多指标的定量测定文献报道比较少，所以有必要建立一种多指标的测定方法[10, 11]。为了提高香青兰药材的利用率和判断药材的优劣，本实验以多个有效成分（I、II、III、IV、田蓟苷和迷迭香酸）的提取率为指标，考察香青兰的提取工艺，采用L9(34) 正交试验对香青兰有效成分的提取工艺进行探讨研究，从而确定最佳提取工艺，根据最佳提取工艺，对4个不同产地的香青兰中I、II、III、IV、田蓟苷和迷迭香酸的量进行比较分析，为香青兰原料的选择和质量检测提供参考。
1 仪器与试药日本岛津SPD-10AVP型高效液相色谱仪，日本岛津制造所；AB135-S梅特勒-托利多电子天平，梅特勒-托利多国际股份有限公司；WP-UP-IV-10型Water Purifier实验室专用超纯水机，四川沃特尔科技发展有限公司；JM-B2003电子天平，余姚市纪铭称重校验设备有限公司；KQ-100 DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
香青兰采自新疆吉木萨尔、于田、墨玉、阜康4个产地，经新疆药物研究所何江副研究员鉴定为唇形科植物香青兰Dracocephalum moldevica L. 的干燥地上部分；对照品I和II购自上海一林生物科技有限公司（质量分数＞98%）；对照品田蓟苷、III和IV均为实验室自制，其结构通过1H-NMR和13C-NMR数据与文献报道的数据比对而确定，经HPLC归一法测定质量分数均在98%以上；对照品迷迭香酸（批号111871-201001）购自中国食品药品检定研究院（质量分数以98.8%计）；乙腈（色谱纯）；甲酸（分析纯）；双蒸水；其余试剂为分析纯。
2 方法与结果 2.1 指标成分的定量测定 2.1.1 色谱条件色谱柱为Shim-pack ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.5%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～30 min，18%乙腈；30～60 min，18%～30%乙腈；60～75 min，30%乙腈；体积流量为1.0 mL/min；检测波长为330 nm；柱温为35 ℃；进样量10 μL。
2.1.2 对照品溶液的制备分别精密称取I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV对照品适量，加70%乙醇水溶液制成含I 149.6 μg/mL、II 116.5 μg/mL、迷迭香酸207.36 μg/mL、III 139.2 μg/mL、田蓟苷395 μg/mL、IV 234 μg/mL的混合对照品储备液。
2.1.3 供试品溶液的制备精密移取提取液，滤过，取续滤液作为各提取液的供试品溶液。
2.1.4 线性关系考察分别精密吸取“2.1.2”项下的混合对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置10 mL量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液。分别吸取10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，以对照品的质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，并进行回归计算，得6种指标成分的回归方程、相关系数（r）和线性范围分别为I：Y＝14 784 X＋4 201.2，r＝0.999 7，线性范围7.48～59.84 μg/mL；II：Y＝14 709 X－156.34，r＝0.999 7，线性范围5.825～46.6 μg/mL；迷迭香酸：Y＝36 953 X＋651.62，r＝0.999 6，线性范围10.368～82.944 μg/mL；III：Y＝12 574 X－2 545.9，r＝0.999 6，线性范围6.96～55.68 μg/mL；田蓟苷：Y＝30 882 X－6 629.5，r＝0.999 5，线性范围19.75～158 μg/mL；IV：Y＝5 513.2 X＋2937，r＝0.999 4，线性范围11.70～93.60 μg/mL。
2.1.5 精密度试验取含I 29.92 μg/mL、II 23.3 μg/mL、迷迭香酸41.472 μg/mL、III 27.84 μg/mL、田蓟苷79 μg/mL和IV 46.8 μg/mL的混合对照品溶液，重复进样6次，结果I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV峰面积的RSD分别为1.22%、0.92%、0.68%、0.70%、1.07%和0.85%。
2.1.6 稳定性试验取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12 h分别进样，每次进样10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，结果I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV峰面积的RSD分别为0.81%、0.65%、0.79%、0.89%、1.20%和0.91%。
2.1.7 重复性试验取同一批香青兰药材共6份，每份1.0 g，依法制备样品，测定各指标成分的峰面积，并计算I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV质量分数的RSD分别为1.21%、1.05%、0.99%、1.09%、1.63%和1.38%。
2.1.8 加样回收率试验精密量取香青兰药材共6份，每份0.5 g，分别置100 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入“2.1.2”混合对照品溶液7.0 mL，依法制备样品，测定各供试品溶液中I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的平均回收率分别为99.95%、98.10%、100.47%、101.11%、98.66%、99.01%，RSD分别为1.38%、1.67%、1.62%、1.18%、0.99%、1.89%。
2.1.9 提取液中指标成分的测定分别吸取含I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的混合对照品和供试品溶液各10 μL，照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，色谱图见图 1。
 | 图 1 混合对照品 (A) 和供试品溶液 (B) 的HPLC图Fig. 1 HPLC of mixed reference (A) and extract solution (B) |
精密移取提取液50 mL，置已干燥至恒定质量的蒸发皿中，在水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却1 h，迅速精密称定质量，计算浸出物的量。
2.2 乙醇回流提取工艺分别称取新疆吉木萨尔县产香青兰，加入一定量一定体积分数的乙醇水溶液，进行加热回流提取，得提取液，分别测定提取液中I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的质量浓度，计算提取率。
提取率＝提取液中指标成分的质量浓度×提取液体积/药材中指标成分的总质量
2.3 单因素考察试验 2.3.1 提取溶媒考察分别称取新疆吉木萨尔县产香青兰8份，每份20 g，分别加40倍量水及10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇水溶液，加热回流提取2次，提取时间为3 h，每次1.5 h，滤过，合并2次滤液，用相应的溶剂定容至1 000 mL，照“2.1.1”项下色谱条件，测定提取液中I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的质量浓度，分别计算其提取率。结果见表 1。由以上实验结果可知，40%乙醇提取液中II、迷迭香酸、田蓟苷和IV提取率最高，I和III在40%乙醇提取液中提取率较高，故采用40%乙醇水溶液进行后续单因素考察。同时，20%乙醇水溶液对I和III的提取率最高，因此，选择20%、40%、60%乙醇进行正交试验考察。
2.3.2 提取次数的选择分别称取新疆吉木萨尔县产香青兰4份，每份20 g，设定提取次数为1、2、3、4次，共加40倍量的40%乙醇水溶液，加热回流提取3 h，提取操作如下：（1次）香青兰药材20 g，加入40倍量的40%乙醇水溶液，加热回流提取1次，3 h；滤过，滤液置1 000 mL量瓶中，用40%乙醇水溶液定容至刻度，药渣弃去；（2次）香青兰药材20 g，先加入20倍量的40%乙醇水溶液，加 热回流提取1次，提取时间为1.5 h，滤过，药渣照上法再提取1次，滤过，合并以上2次的提取液，置1 000 mL量瓶中，用40%乙醇水溶液定容至刻度，药渣弃去；（3次）香青兰药材20 g，先加入15倍量的40%乙醇水溶液，提取1次，1.0 h，滤过，药渣照上法再提取2次（第3次加10倍量的40%乙醇水溶液，其他操作相同），滤过，合并以上3次的提取液置1 000 mL量瓶中，用40%乙醇水溶液定容至刻度，药渣弃去；（4次）香青兰药材20 g，先加入10倍量40%乙醇水溶液，提取1次，提取时间为1.0 h，滤过，药渣照上法再提取3次（第3、4次提取时间为0.5 h，其他操作相同），滤过，合并以上4次的提取液置1 000 mL量瓶中，用40%乙醇水溶液定容至刻度，药渣弃去。
照“2.1.1”项色谱条件，测定以上4份提取液中I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的质量浓度，分别计算其提取率，结果见表 2。由以上实验结果可知，在共加入40倍量的40%乙醇水溶液，加热回流提取3 h的前提下，考察提取次数（1、2、3、4次）对6指标成分提取率的影响，本实验重复3次，结果均为1次提取率较高，因此，确定提取1次，进行后续实验。
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表 1 不同提取溶媒对指标成分提取率的影响 Table 1 Effect of different extracting solvents on extraction rates of index components |
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表 2 不同提取次数对指标成分提取率的影响(n = 3) Table 2 Effect of different extracting times on extraction rates of index components (n = 3) |
分别称取新疆吉木萨尔县产香青兰9份，每份20 g，分别加入20、25、30、35、40、45、50、55、60倍量40%乙醇水溶液，加热回流提取1次，提取时间为3 h，滤液滤过置1 000 mL量瓶中，用40%乙醇水溶液定容至刻度，照“2.1.1”项下色谱条件测定提取液中I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的质量浓度，分别计算其提取率。结果见表 3。由以上实验结果可知，当40%乙醇水溶液用量为40倍时，各指标成分的提取率均能达到60%以上，且40倍时各指标成分的提取率占60倍量提取率的90%以上，因此，采用40倍量40%乙醇溶液，进行后续单因素考察，且50倍时各指标成分的提取率占60倍量提取率的95%以上，因此，选择30、40、50倍进行正交试验。
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表 3 不同溶媒倍量对指标成分提取率的影响 Table 3 Effect of different ethanol volumes on extraction rates of index components |
分别称取新疆吉木萨尔县产香青兰5份，每份20 g，加入40倍量40%乙醇水溶液，加热回流提取1次，每次提取时间分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h，滤液滤过置1 000 mL量瓶中，用40%乙醇水溶液定容至刻度，照“2.1.1”项下色谱条件测定提取液中I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的质量浓度，分别计算其提取率。结果见表 4。由结果可知，6指标成分的提取率随提取时间的增长而增大，II、迷迭香酸、III、田蓟苷在提取5.0 h与6.0 h的提取率接近，且6指标成分在提取4.0 h的提取率均占6.0 h提取率的83%以上，因此，选择4.0、5.0、6.0 h进行正交试验。
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表 4 不同提取时间对指标成分提取率的影响 Table 4 Effect of different extracting time on extraction rates of index components |
根据以上单因素试验结果，提取次数为1次时，提取液中6指标成分的提取率均最高，因此，固定提取次数为1次，采用正交试验设计，选取乙醇体积分数（A）、乙醇倍数（B）、提取时间（C）3个因素，设计每个因素选取3个水平，因素水平表见表 5。以I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的提取率和浸出物得率为评价指标，采用L9(34) 正交试验表安排试验，选择综合加权评分法对试验结果进行方差分析。文献报道迷迭香酸是丹参等中药的有效活性成分，具有明确的抗血栓和抗血小板凝集，对心血管系统具有明显保护作用；同时，本课题组目前已经进行了I、II、III、田蓟苷和IV这5个成分对冠心病作用的药效学试验，其中I、II、III和IV均有不同程度的抑制血小板聚集的作用，且I、III、IV抑制血小板聚集的作用较明显；田蓟苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用。因此，设定满分为100分，6个化合物的权重系数分别为15、10、20、15、15、15，浸出物得率权重系数为10，在此基础上进行加权评分。取新疆吉木萨尔县产香青兰20 g，按照L9(34) 正交试验表安排进行试验，每个样品提取完毕，滤过，合并滤液，用相应的溶剂定容至1 000 mL，照“2.1.1”项下色谱条件，测定提取液中I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的质量浓度，分别计算其提取率。浸出物得率和各指标成分提取率结果见表 5，正交试验结果见表 5。
综合评分＝I提取率/I最大提取率×15＋II提取率/II最大提取率×10＋迷迭香酸提取率/迷迭香酸最大提取率×20＋III提取率/III最大提取率×15＋田蓟苷提取率/田蓟苷最大提取率×15＋IV提取率/IV最大提取率×15＋浸膏物得率/最大浸膏物得率×10
由直观分析可知，影响提取效果的因素为A＞C＞B，以乙醇体积分数影响最大。每个因素3个水平之间的趋势为A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1。经方差分析结果（表 6）可知，A和C因素对指标成分的提取效果有显著性影响，B因素对指标成分的提取效果无显著性影响，因此从大工业生产和降低成本、节省工时等方面综合考虑，确定最佳工艺为A2B1C3，即30倍量40%乙醇水溶液，提取1次5 h。
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表 5 正交试验设计与结果 Table 5 Design and results of orthogonal test |
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表 6 方差分析 Table 6 Analysis of variance |
为验证上述结果的准确性，保证提取工艺的合理可行，按上述己确定最佳工艺条件，分别取3个批次新疆吉木萨尔县产香青兰药材各20 g，对优选的最佳工艺进行验证，照“2.1.1”项下色谱条件测定提取液中I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的质量浓度，分别计算其提取率。结果见表 7。结果表明，该工艺稳定、合理、可靠，可为工业生产提供理论依据。
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表 7 提取工艺验证试验 Table 7 ATest of varification in extracting technology |
分别称取吉木萨尔、于田、墨玉、阜康产的香青兰药材各20 g，按照“2.4”项确定的提取工艺进行提取，照“2.1.1”项下色谱条件测定提取液中I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的量。结果见表 8。由表 8的测定结果可以看出，不同产地香青兰药材中I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和IV的量差异较大。吉木萨尔产的香青兰药材中6种指标成分的量最高，墨玉产的香青兰药材中I、II、田蓟苷和IV的量最低，于田产的香青兰药材中迷迭香酸、III的量最低。同时，吉木萨尔产香青兰药材各指标成分提取率均到达85%以上，这进一步验证了优选的最佳提取工艺的稳定性和可行性。
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表 8 不同产地香青兰中指标成分的测定结果 Table 8 Determination of index components in aerial parts of D. moldavic from different habitats |
首先采用单因素试验考察乙醇体积分数、加醇倍量、提取时间和提取次数4个因素对6个指标成分提取率的影响，结果，在总的提取时间为3 h的前提下，考察提取次数对6指标成分提取率的影响 时，6个指标成分提取率，随着提取次数的增加而降低，重复3次试验的结果均是提取1次时，6个指标成分提取率最高，因此，固定提取次数为1次。再采用正交试验对其他影响提取工艺的因素进行优化，结果乙醇体积分数有显著性影响，提取时间也有一定的影响，从工业生产和节能降耗等方面考虑，以A2B1C3组合为佳，即40%乙醇水溶液，加30倍量，提取1次，提取5 h。
据现有文献表明[10, 11, 12, 13]，香青兰提取都是以香青兰中单个成分或2个成分作为考察指标，本实验以香青兰药材中多个活性成分和浸出物作为指标，筛选提取工艺，有利于兼顾各指标的协同效应，符合中药多成分多靶点起效的特点，较单一指标筛选更加科学、合理，而且操作方法简便，结果容易统计，且优化后的提取工艺结果稳定可靠，可为进一步开发利用提供重要依据。
根据文献报道[10, 11, 12, 13, 14]比较了甲醇-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液流动相系统的洗脱情况，发现以甲醇-磷酸水溶液作为流动相时，田蓟苷和IV都不能实现基线分离，以乙腈-甲酸水溶液作为流动相，各指标成分的分离较好，故选择乙腈-甲酸水溶液作为流动相，为了使6个指标成分在较短的时间内出峰，选择乙腈-甲酸水溶液梯度洗脱。
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