虫草属真菌为子囊菌纲麦角菌目麦角菌科的一类大型药用真菌，全世界已报道的虫草属品种多达500种以上，而我国已报道的虫草属品种约有120种^[1]。雪峰虫草是一种生长在海拔300～1 000 m的活体植物马鞭草科大青的近地面根髓或茎髓中的一种真菌，为麦角菌科线虫草菌属的一个新种，是目前全世界报道的最大的虫草^[2]。经采用真菌分类学、分子生物学鉴定发现，雪峰虫草与冬虫夏草的亲缘关系很近^[2]。雪峰虫草早期主要在湖南省洞口县瑶族民间使用，后来被广泛流传并用来防病治病，具有补肺益肾、止咳化痰的功效，主治肾虚精亏、阳痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘等症效果显著。然而雪峰虫草的化学成分及药效作用的物质基础尚不明确，因此对于雪峰虫草化学成分的研究工作十分重要。本研究首次采用高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法（HPLC-Q-TOF-MS）分析雪峰虫草主要化学成分，采用电喷雾电离源正离子模式和负离子模式对色谱流出物进行检测，通过高分辨质谱分析结合对照品数据及相关文献共鉴定28个化合物，其主要成分为甘露醇、腺苷、麦角甾醇、谷甾醇、氨基酸、脂肪酸、糖类等。为雪峰虫草的药效物质基础和质量评价提供了快捷、有效的检测方法。

KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），1200 Series型高效液相色谱系统（安捷伦科技公司），配四元泵及在线脱气，紫外检测器。6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS/MS（安捷伦科技公司）。

乙腈、甲醇色谱纯（德国Merck公司）；甲酸色谱纯，美国Tedia公司）；水为纯净水（潍坊娃哈哈饮料有限公司），其余试剂为分析纯。麦角甾醇（批号869-200202）和β-谷甾醇（批号110851- 201407）均购自中国食品药品检定研究院。

本实验所采用的雪峰虫草均采自湖南省洞口县，批号20120426，经贵州大学西南药用生物资源教育部工程研究中心文庭池教授和湖南省中医药研究院朱如彩研究员共同鉴定为雪峰虫草Ophiocordyceps xuefengensis sp. nov.。

月旭AQ-C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）。使用前超声脱气，用0.22 μm微孔滤膜滤过；梯度洗脱程序：0～15 min，2% A；15～30 min，2%～5% A；30～48 min，5%～65% A；48～68 min，65%～100% A；68～83 min，100% A；柱温为30 ℃，体积流量1.0 mL/min，进样量10 μL。检测波长260 nm。

离子化方式：电喷雾离子化（ESI）；干燥气温度325 ℃；干燥气体积流量为6.8 L/min；鞘气温度350℃；毛细管电压4.0 kV；碎片电压130 V。

分别精密称取β-谷甾醇和麦角甾醇对照品0.1和0.5 mg于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，4 ℃冷藏备用，进样前0.45 μm微孔滤膜滤过。

取雪峰虫草适量，低温（40 ℃）烘干至恒定质量，粉碎，过60目筛。精确称取0.5 g样品于具塞锥形瓶中，加入80%甲醇10 mL，超声40 min，再用80%甲醇补足减失的质量。进样前用0.45 μm微孔滤膜滤过。

在拟定分析条件下，雪峰虫草醇提取物在正、负离子模式下，全扫描总离子流图见图 1。同时对正、负离子模式下，一、二级质谱图进行分析，根据其反相色谱保留行为、紫外检测和质谱特征，结合文献数据进行结构鉴定，共确定28个化学成分（表 1），结构类型可分为5类。

图 1 雪峰虫草HPLC-Q-TOF/MS正离子 (A) 和负离子(B) 模式总离子流图Fig. 1 HPLC-Q-TOF/MS total ion chromatogram of positive ion (A) and negative ion (B) of O.xuefengensis sp. nov.

表 1(Table 1)

表 1 雪峰虫草HPLC-Q-TOF-MS 分析结果 Table 1 Analysis results for O. xuefengensis sp. nov. by HPLC-Q-TOF-MS tR/min 离子峰归属 质荷比（m/z） 二级碎片离子 偏差 分子式 化合物 实测值 理论值 2.478 [M＋H]＋ 147.112 0 147.112 8 130.086 4,101.070 9,84.080 9 5.44 C6H14N2O2 赖氨酸 2.620 [M＋H]＋ 175.118 8 175.119 0 158.091 8,130.093 2,116.069 9, 84.081 1 1.14 C6H14N4O2 精氨酸 2.754 [M－H]－ 154.061 4 154.062 2 137.036 2,93.046 1 5.19 C6H9N3O2 组氨酸 3.117 [M－H]－ 118.050 6 118.051 0 100.039 0,74.025 8 3.39 C4H9NO3 苏氨酸 3.175 [M－H]－ 132.029 9 132.030 2 115.003 4,88.040 8,70.014 5 3.03 C4H7NO4 天门冬氨酸 3.346 [M＋H]＋ 118.085 8 118.086 3 102.053 4,74.060 8,59.073 6 4.23 C5H11NO2 缬氨酸 3.487 [M＋H]＋ 148.059 8 148.060 4 130.049 3,102.054 8,84.044 8 4.05 C5H9NO4 谷氨酸 3.504 [M－H]－ 181.072 3 181.071 8 163.059 9,101.024 3,89.024 7 2.76 C6H14O6 甘露醇 3.584 [M－H]－ 114.055 9 114.056 1 85.027 7,68.996 0 1.56 C5H9NO2 脯氨酸 3.768 [M＋COOH]－ 387.114 7 387.114 4 285.116 4,119.028 6 0.77 C12H22O11 蔗糖 4.805 [M＋H]＋ 136.061 1 136.061 8 119.035 0 5.14 C5H5N5 腺嘌呤 5.541 [M＋H]＋ 152.056 2 152.056 7 135.029 4,110.034 6 3.29 C5H5N5O 鸟嘌呤 5.906 [M－H]－ 111.019 7 111.020 0 41.999 3 2.70 C4H4N2O2 尿嘧啶 6.689 [M＋H]＋ 132.101 3 132.101 9 86.096 6,55.055 1 4.54 C6H13NO2 亮氨酸 9.366 [M－H]－ 180.066 4 180.066 6 163.038 0,119.048 6 1.11 C9H11NO3 酪氨酸 9.399 [M－H]－ 135.030 9 135.031 2 92.025 0,65.014 6 2.20 C5H4N4O 次黄嘌呤 11.276 [M＋H]＋ 153.040 2 153.040 7 136.013 5,110.034 8 3.27 C5H4N4O2 黄嘌呤 12.243 [M－H]－ 243.062 2 243.062 3 110.021 5,41.998 6 0.42 C9H12N2O6 尿苷 18.647 [M＋H]＋ 166.085 3 166.086 3 149.059 6,131.049 1,120.080 1 6.02 C9H11NO2 苯丙氨酸 18.805 [M＋H]＋ 268.102 9 268.104 0 136.061 1 4.10 C10H13N5O4 腺苷 22.983 [M＋H]＋ 252.107 6 252.109 1 136.061 3 5.95 C10H13N5O3 虫草素 64.593 [M－H]－ 315.253 7 315.254 1 / 1.27 C18H36O4 9,10-二羟基硬脂酸 69.626 [M－H]－ 277.216 8 277.217 3 163.112 6,96.956 7,79.957 6 1.80 C18H30O2 亚麻酸 70.480 [M－H]－ 279.232 3 279.233 0 228.203 3,44.999 3 2.51 C18H32O2 亚油酸 71.272 [M－H]－ 255.232 5 255.233 0 / 1.96 C16H32O2 棕榈酸 73.562 [M－H]－ 283.263 3 283.264 3 / 3.50 C18H36O2 硬脂酸

表 1 雪峰虫草HPLC-Q-TOF-MS 分析结果 Table 1 Analysis results for O. xuefengensis sp. nov. by HPLC-Q-TOF-MS

在“2.1”和“2.2”项条件下检测β-谷甾醇和麦角甾醇2种对照品发现，它们在ESI离子源中很难电离。实验通过对照品在反相色谱柱上的保留特征对这2种物质进行定性。其保留时间分别为64.821 min和76.605 min，见图 2。

1-β-谷甾醇 2-麦角甾醇 1-β-sitosterol 2-ergosterol图 2 对照品(A) 和雪峰虫草 (B) 的RP-HPLC色谱图Fig. 2 RP-HPLC of reference substances (A) and O. xuefengensis sp. nov. (B)

普通虫草中通常存在大量的D-甘露醇，从雪峰虫草中鉴定出D-甘露醇和蔗糖2种糖类化合物。保留时间为3.504 min获得m/z 181.072 3 [M－H]^- 质谱信号，根据数据库搜索得到分子式为C₆H₁₄O₆，根据文献报道^[3]，D-甘露醇相对分子质量为182，推测为其分子离子峰。对m/z 181.072 3进行MS²分析得到它的二级碎片离子为m/z 163.059 9、101.024 3、89.024 7，可能的断裂方式见图 3。

图 3 甘露醇的MS2裂解途径Fig. 3 MS2 fragmentation pathway of mannitol

保留时间3.768 min获得m/z 387.114 7 [M＋COOH]^-质谱信号，根据数据库搜索得到分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，根据文献报道^[4]推测该化合物为蔗糖。

虫草中常见的物质有腺苷等核苷类物质，实验从雪峰虫草中鉴定8种核苷类化合物，分别为腺苷、虫草素、腺嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、尿苷和尿嘧啶。在正离子模式下，保留时间为18.805和22.983 min分别获得m/z 268.102 9和m/z 252.107 6 [M＋H]⁺ 的质谱信号，二级质谱两者均出现m/z 136，根据数据库搜索得到分子式为C₁₀H₁₃N₅O₄和C₁₀H₁₃N₅O₃，推测该化合物为腺苷和虫草素，二级碎片离子为两者丢失糖苷元。保留时间为4.805、5.541和11.276 min，分别获得m/z 136.061 1、m/z 152.056 2和m/z 153.040 2 的 [M＋H]⁺质谱信号，根据数据库搜索得到分子式为C₅H₅N₅、C₅H₅N₅O和C₅H₄N₄O₂，二级质谱均出现了[M＋H－NH₃]⁺，根据文献报道^[5]，推测其分别为腺嘌呤、鸟嘌呤和黄嘌呤。对m/z 152.056 2的信号进行MS²分析，得到的二级碎片离子为m/z 135.029 4,110.034 6，可能的断裂方式见图 4。

图 4 鸟嘌呤和尿嘧啶的MS2裂解途径Fig. 4 MS2 fragmentation pathway of guanine and uracil

在负离子模式下，保留时间为5.906和12.243 min分别获得m/z111.0197和m/z243.0622 的 [M－H]^-质谱信号，根据数据库搜索得到分子式为C₄H₄N₂O₂和C₉H₁₂N₂O₆。推测其为尿嘧啶和尿苷的分子离子峰，二级质谱均出现m/z 42碎片离子，根据文献报道^[6]该碎片离子的断裂可能途径见图 4。保留时间为9.399 min得到m/z135.030 9[M－H]^-，根据数据库搜索得到分子式为C₅H₄N₄O，推测为次黄嘌呤分子离子峰。对m/z135.030 9信号进行MS²分析得到它的二级碎片离子为m/z 92.025 0、65.014 6，其可能的断裂途径是次黄嘌呤开环失去中性分子HNCHNH和CO。

虫草中富含人体必需氨基酸^[7]，氨基酸是一类含有若干个氨基和若干个羧基组成的小分子化合物。通过一、二级质谱数据及文献报道^[8]，实验在正、负离子模式下共鉴定出11种氨基酸，分别为组氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸和精氨酸。

在正离子模式下，保留时间分别为2.478、2.620、3.346、3.487、6.689和18.647 min得到的质谱信号分别为m/z 147.112 0 [M＋H]⁺、175.119 0 [M＋H]⁺、118.085 8 [M＋H]⁺、148.059 8 [M＋H]⁺、132.101 3 [M＋H]⁺ 和166.085 3 [M＋H]⁺；二级质谱均出现了 [M＋H－NH₃]⁺ 和 [M＋H-HCOOH]⁺ 的碎片峰，根据文献报道^[9]，在正离子模式下大多数氨基酸失去NH₃和HCOOH。经数据库搜索得到分子式分别为C₆H₁₄N₂O₂、C₆H₁₄N₄O₂、C₅H₁₁NO₂、C₅H₉NO₄、C₆H₁₃NO₂、C₉H₁₁NO₂，推测这些化合物分别为赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。

在负离子模式下，保留时间分别为2.754、3.117、3.175、3.584和9.366 min得到的质谱信号分别为m/z 154.061 4 [M－H]^-、118.050 6 [M－H]^-、132.029 9 [M－H]^-、114.055 9 [M－H]^-和180.066 4 [M－H]^-，二级质谱均出现了 [M－H－NH₃]^- 和 [M－H－CO₂]^- 的碎片峰，可能是由氨基酸失去NH₃和CO₂，根据数据库搜索得到分子式分别为C₆H₉N₃O₂、C₄H₉NO₃、C₄H₇NO₄、C₅H₉NO₂和C₉H₁₁NO₃，推测这些化合物分别为组氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸、脯氨酸和酪氨酸。

根据MUSSHUNTER软件以及中草药数据库，参考文献的研究结果，本实验还从雪峰虫草的醇提取物中鉴定出了一些其他化合物，其结构可能是棕榈酸^[4]、硬脂酸^[10]、亚麻酸^[11]、亚油酸^[11]和9,10-二羟基硬脂酸^[12]。

选择了迪马C₁₈柱、氨基柱、月旭AQ-C₁₈柱3种色谱柱，经实验发现，迪马C₁₈柱适合分离极性化合物，但弱极性化合物很难被洗脱下来；氨基柱可以很好地分离氨基酸类化合物，而其他物质很难分离检测到；在月旭AQ-C₁₈柱中雪峰虫草醇提取物能最大限度地分离，这有利于质谱定性分析。雪蜂虫草样品前处理选择50%、80%、100%甲醇及水，以80%甲醇作为提取液得到峰数及峰型最好。流动相考察了甲醇-水、甲醇-水（0.1%甲酸），在纯水作为流动相的情况下，样品中极性化合物分离效果较好，但是部分峰有拖尾现象；甲醇-水（0.1%甲酸）作为流动相时，峰形得到一定改善，在进行质谱检测时，加入甲酸可提高样品中各化合物离子化效率。

采用正、负离子模式同时扫描样品，发现正离子模式条件下，总离子流色谱峰较多，峰信息量大。但有些物质在负离子模式响应较好，实验选用2种模式同时测定样品，最大程度地获取质谱信息。

雪峰虫草属于虫草类的新物种，研究其化学成分具有重要意义。本实验采用HPLC-Q-TOF-MS/MS联用技术，首次对雪峰虫草中化学成分进行快速鉴定，通过获得色谱峰分子离子，对雪峰虫草醇提取物的主要化学成分进行分析鉴定，再通过二级碎片离子对其加以确认。共推测鉴定出28个化合物，为这一新物种药效作用的物质基础提供参考依据。从样品总离子流图可以看出，有一些响应较好的色谱峰其质量数未能在已有数据库中找到，证明雪峰虫草中还有一些未知成分，有待进一步研究开发。