玉叶金花属Mussaenda L. 隶属于茜草科（Rubiaceae），本属植物为攀援灌木或藤本。玉叶金花属，全世界约120种，分布于热带亚洲、非洲及太平洋诸岛，我国产28种，1变种^[1]。该属植物地理分布范围广，形态变异大，部分类群地理分布区重叠，近缘类群难以区别。因此，利用形态学的方法进行物种鉴别存在一定困难。该属植物具有较高的药用价值。据《中华本草》和《中药大辞典》记载以及相关研究报道，玉叶金花Mussaenda pubescens W. T. Aiton、广西玉叶金花M. kwangsiensis H. L. Li和黐花M. shikokiana H. Lévl等含有萜类、三萜皂苷类等成分，其干燥茎、根具有清热解暑、凉血、解毒的功效，可用于治疗感冒、中暑和呼吸道疾病^{[2, 3, 4, 5]}。然而，由于该属形态鉴定困难，野生资源受到威胁，一些非药用种类常被作为替代品，降低了其药用价值^[6]。前人已对该属植物进行了分类学研究，但是关于该属植物的分子鉴定研究目前尚未见报道。

随着分子生物技术的发展，DNA条形码（DNA barcoding）为植物准确、有效地鉴定提供了更为方便快捷的方法。该技术运用一个或多个DNA片段进行物种鉴定^[7]，结果准确率高、重复率高，不受环境、物种等因素限制，方法通用性强。CBOL Plant Working Group^[8]建议叶绿体片段rbcL和matK组合作为陆生植物的核心DNA条形码，并提出将trnH-psbA和核基因ITS作为DNA条形码候选片段^{[9, 10]}。以上条形码片段在种间及种下具有较快进化速率，变异程度较高，适用于近缘种及种下物种鉴定^[11]。在药用植物条形码研究中，大量研究表明ITS2片段在中药材鉴定中具有重要价值，是药用植物鉴定的有效工具^{[12, 13, 14, 15]}。同时，以上各片段均已成功应用于茜草科植物的DNA条形码研究^{[13, 16, 17]}。基于此，本研究将核心条形码片段rbcL和matK、候选条形码片段trnH-psbA和ITS以及ITS2片段相结合，对玉叶金花属植物进行DNA条形码物种鉴定研究，并为该属药用植物种类的鉴定提供初步的分子证据和鉴定工具。

本研究一共包括玉叶金花属20个种、89份个体，每个种至少包括2个个体。由中国科学院华南植物园标本馆张奠湘研究员鉴定为贡山玉叶金花Mussaenda treutleri Stapf、展枝玉叶金花Mussaenda divaricate Hutchins.、疏花玉叶金花Mussaenda laxiflora Hutchins.、短裂玉叶金花Mussaenda breviloba S. Moore、大叶玉叶金花Mussaenda macrophylla Wall.、狭瓣玉叶金花Mussaenda lancipetala X. F. Deng & D. X. Zhang、红毛玉叶金花Mussaenda hossei Craib、多脉玉叶金花Mussaenda multinervis C. Y. Wu ex Hsue et H. Wu、洋玉叶金花Mussaenda frondosa Linn.、粗毛玉叶金花Mussaenda hirsutula Miq.、海南玉叶金花Mussaenda hainanensis Merr.、广东玉叶金花Mussaenda kwangtungensis Li、玉叶金花玉叶金花原变型Mussaenda pubescens W. T. Ait. f. pubesscens、白花玉叶金花Mussaenda pubescens W. T. Ait. f. var. alba X. F. Deng et D. X. Zhang、仁昌玉叶金花Mussaenda chingii Y. C. Wu ex Hsue et H. Wu、黐花M. shikokiana H. Lévl、壮丽玉叶金花Mussaenda antiloga Chun et Ko、长瓣玉叶金花Mussaenda longipetala H. L. Li、单裂玉叶金花Mussaenda simpliciloba Hand. -Mazz.、广西玉叶金花Mussaenda kwangsiensis Li、粉纸扇Mussaenda philippica A. Rich. cv. Queen Sirkit、裂果金花Schizomussaenda henryi (Hutch.) X. F. Deng & D. X. Zhang、假玉叶金花Pseudomussaenda flava Verdc.。其中药用种类为玉叶金花、白花玉叶金花、广西玉叶金花和黐花，其他种类的药用价值目前尚不明确，以假玉叶金花和裂果金花作为外类群。在有多个居群材料的情况下，尽可能选取来自不同居群的样品，以涵盖物种内部的遗传变异。居群样品采自广东、广西、云南、四川、海南等地，全部凭证标本均保存在华南植物园标本馆（IBSC）。采集植物新鲜叶片，经硅胶快速干燥后保存。样品信息见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 样品信息 Table 1 Sample information 编号 样本 标本号 采集地 编号 样本 标本号 采集地 1 贡山玉叶金花 Deng X.F.340 云南省福贡 47 玉叶金花原变型 Duan T.T.631 广东省茂名市电白县麻岗镇热水乡 2 Deng X.F.347 云南省福贡 48 Gong W.47 广东省象头山 3 展枝玉叶金花 Duan T.T.417 四川省宜宾 49 Gong W.76 广东省广州市龙洞宵箕窝 4 Duan T.T.418 四川省宜宾 50 Gong W.51 广东省东莞市观音山 5 Duan T.T.419 四川省宜宾 51 Gong W.77 江西省大余 6 疏花玉叶金花 Deng X.F.361 云南省金平 52 Gong W.78 江西省会昌 7 Duan T.T.436 云南省屏边 53 Gong W.83 香港大学 8 Duan T.T.432 云南省屏边 54 白花玉叶金花 Gong W.81 福建省上杭 9 Duan T.T.433 云南省屏边 55 Gong W.49 广东省东莞市观音山 10 短裂玉叶金花 Duan T.T.579 云南省勐海 56 Gong W.82 广东省深圳市梧桐山 11 Duan T.T.580 云南省勐海 57 Gong W.79 江西省大余 12 Duan T.T.581 云南省勐海 58 Gong W.80 江西省吉安 13 Duan T.T.582 云南省勐海 59 Deng X.F.184 广东省广州市 14 Deng X.F.423 云南省勐海 60 仁昌玉叶金花 Deng X.F.236 广西壮族自治区罗城 15 Deng X.F.387 云南省思茅 61 Duan T.T.673-1 广西壮族自治区罗城 16 大叶玉叶金花 Deng X.F.408 云南省勐仑 62 Duan T.T.673-2 广西壮族自治区罗城 17 Deng X.F.401 云南省版纳 63 Duan T.T.673-3 广西壮族自治区罗城 18 Duan T.T.471 云南省绿春 64 Duan T.T.673-5 广西壮族自治区罗城 19 狭瓣玉叶金花 Duan T.T.515 云南省绿春 65 Duan T.T.673-4 广西壮族自治区罗城 20 Duan T.T.516 云南省绿春 66 黐花 Deng X.F.215 广西壮族自治区金秀 21 Duan T.T.517 云南省绿春 67 Chen S.52 江西省井冈山 22 Duan T.T.518 云南省绿春 68 Chen S.78-1 广西壮族自治区七分山 23 Deng X.F.410 云南省勐腊 69 Chen S.78-2 广西壮族自治区七分山 24 Deng X.F.457 云南省勐腊 70 Chen S.78-3 广西壮族自治区七分山 25 红毛玉叶金花 Duan T.T.546 云南勐腊磨憨苗寨 71 Chen S.78-4 广西壮族自治区七分山 26 Deng X.F.416 云南省勐腊至勐仑途中 72 Chen S.78-5 广西壮族自治区七分山 27 Duan T.T.547 云南勐腊磨憨苗寨 73 壮丽玉叶金花 Duan T.T.75 海南省乐东县尖峰岭 28 Duan T.T.548 云南勐腊磨憨苗寨 74 Duan T.T.78 海南省乐东县尖峰岭 29 多脉玉叶金花 Duan T.T.464 云南省绿春 75 长瓣玉叶金花 Duan T.T.180 广西壮族自治区那坡县 30 Duan T.T.466 云南省绿春 76 Duan T.T.181 广西壮族自治区那坡县 31 Duan T.T.467 云南省绿春 77 Duan T.T.182 广西壮族自治区那坡县 32 Duan T.T.468 云南省绿春 78 单裂玉叶金花 Duan T.T.421 四川省凉山德昌县蒲坝 33 Deng X.F.418 云南省勐腊 79 Duan T.T.422 四川省凉山德昌县蒲坝 34 Deng X.F.444 云南省勐腊 80 Duan T.T.423 四川省凉山德昌县蒲坝 35 洋玉叶金花 Deng X.F.397 云南省勐腊 81 Duan T.T.424 四川省凉山德昌县蒲坝 36 Deng X.F.402 云南省版纳 82 Duan T.T.425 四川省凉山德昌县蒲坝 37 粗毛玉叶金花 Duan T.T.66 海南省乐东县尖峰岭 83 广西玉叶金花 Duan T.T.197 广西壮族自治区凌云县玉洪乡 38 Duan T.T.67 海南省乐东县尖峰岭 84 Duan T.T.198 广西壮族自治区凌云县玉洪乡 39 Duan T.T.68 海南省乐东县尖峰岭 85 Duan T.T.199 广西壮族自治区凌云县玉洪乡 40 Duan T.T.69 海南省乐东县尖峰岭 86 Duan T.T.200 广西壮族自治区凌云县玉洪乡 41 海南玉叶金花 Duan T.T.70 海南省霸王岭 87 Duan T.T.220 广西壮族自治区凌云县玉洪乡 42 Duan T.T.72 海南省霸王岭 88 粉纸扇 Deng X.F.463 云南省版纳植物园 43 Duan T.T.73 海南省霸王岭 89 Deng X.F.248 海南省万宁市兴隆热带花园 44 广东玉叶金花 Duan T.T.660 广东省台山市北峰山林场 90 裂果金花 Deng X.F.409 云南省勐腊 45 Gong W.50 广东省东莞市观音山 91 假玉叶金花 YS 438 广东省广州市华南植物园温室栽培 46 Zhang D.X.1053 广东省新会古兜山

表 1 样品信息 Table 1 Sample information

硅胶干燥叶片采用改良CTAB法提取总DNA。选用4个片段（rbcL、matK、trnH-psbA和ITS）的引物^{[18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25]}进行PCR扩增。各片段引物信息见表 2。PCR反应用50 μL体系，其中基因组DNA 50 ng，10×PCR 缓冲液，2 mmol/L MgCl₂，0.2 μmol/L dNTPs，引物各0.2 μmol/L，以及Takara（大连宝生物工程有限公司）的PrimeStar Taq酶。PCR反应程序为94 ℃预变性4 min，接着是30个循环反应，包括94 ℃预变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循环反应完成后，72 ℃延伸8 min，最后10 ℃保存。PCR反应结束后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分离、检测，同时电泳3 μL的Maker。条带清晰、单一的扩增产物直接送上海英潍捷基生物工程技术服务公司进行PCR产物直接测序。为保证序列的可靠性，所有片段都进行双向测序。

表 2(Table 2)

表 2 4个条形码片段引物信息 Table 2 Primers information of four barcode fragment 条形码片段 引物名称 序列 (5’-3’) rbcL rbcLa_f ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC 724R TCGCATGTACCTGCAGTAGC matK 3F_KIM CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 1R_KIM ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC XF TAATTTACGATCAATTCATTC trnH-psbA psbA­ 3 GTTATGCATGAACGTAATGCTC trnH-05 CGCGCATGGTGGATTCACAATCC ITS ITS 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS 5HP GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG ITS-NNc18s10 AGGAGAAGTCGTAACAAG ITS-C26A GTTTCTTTTCCTCCGCT

表 2 4个条形码片段引物信息 Table 2 Primers information of four barcode fragment

利用Sequencher 4.1.4（Gene Code Cop.）软件对原始序列数据进行检查和拼接，并使用Se-AL软件^[26]进行人工校正。基于4个片段，计算物种间和物种内的Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离。基于K2P模型，对单一片段和片段组合条形码，使用MEGA 6.0软件，构建邻接（neighbor-joining，NJ）树，并通过1 000次重复的bootstrap值来确定每个分支的支持率。利用TaxonDNA软件，确定遗传距离95%的阈值，并将此阈值标定为种内变异的界限。通过“best match” “best close match”“All species barcodes”功能，对单一片段条形码和片段组合条形码进行序列相似性匹配分析，将所有样品的序列均准确鉴定的物种计入严格匹配的序列中^[27]。

玉叶金花属4个片段的扩增情况见表 3。除trnH-psbA的扩增成功率为95.60%外，其他3个片段的PCR成功率均为100%。在trnH-psbA片段扩增中，红毛玉叶金花和多脉玉叶金花各有2份个体扩增失败。rbcL和matK的测序结果较好，序列不存在插入/缺失位点，序列比对最容易。ITS存在14个位点的插入/缺失，序列长度为750～755 bp，分别为ITS1、5.8 S rRNA和ITS2区域。其中，ITS2长度为262～266 bp，存在6个位点的插入/缺失。trnH-psbA片段含有单拷贝碱基A/T重复，在测序中表现为poly后双峰，且包括29个插入/缺失位点，片段长度为241～285 bp。该片段序列比对具有一定困难，结果需进一步进行手工校对。ITS片段变异位点和信息位点数最多（47个和31个），其中，ITS2区域含有变异位点和信息位点数分别为35和20个。rbcL的变异位点和信息位点均最少（10个和5个）。基于各单一片段的分析结果，玉叶金花属20种植物的种内遗传距离为0.000 3～0.000 7，种间遗传距离（0.002～0.012）大于种内遗传距离。

表 3(Table 3)

表 3 各片段的PCR扩增和测序成功率及各自的序列信息 Table 3 PCRAmplification,sequencing successful rates,and sequence characteristics of each fragment 片段 候选条形码片 段长度/bp 比对后长 度/bp 获得的样 品数 PCR扩增及测序 成功率/% 核苷酸变异数/信 息位点数 种内遗传距 离均值 种间遗传 距离均值 rbcL 554 554 89 100.00 10/5 0.000 5 0.002 matK 794 794 89 100.00 23/21 0.000 6 0.004 trnH-psbA 241～285 325 85 95.51 12/12 0.000 3 0.012 ITS 750～755 765 89 100.00 47/31 0.000 7 0.007 ITS2 262～266 268 89 100.00 35/20 0.000 4 0.008

表 3 各片段的PCR扩增和测序成功率及各自的序列信息 Table 3 PCRAmplification,sequencing successful rates,and sequence characteristics of each fragment

对单一片段和组合片段的条形码，利用序列相似性法和NJ法对玉叶金花属植物进行物种鉴定。在单一片段中，ITS2的分辨率最高，matK和ITS片段的分辨率比rbcL和trnH-psbA高。在组合片段中，matK＋rbcL的分辨率比单一叶绿体片段高，matK＋rbcL＋trnH-psbA的分辨率低于matK＋rbcL＋ITS。matK＋rbcL＋ITS与matK＋rbcL＋trnH-psbA＋ITS的分辨率相当，两者序列相似性法的分辨率为77%，NJ树的分辨率均为75%。ITS2参与的组合片段中，其分辨率均低于ITS参与的组合片段。此外，基于rbcL、ITS、matK＋rbcL、matK＋rbcL＋ITS和matK＋rbcL＋trnH-psbA＋ITS的各条形码，序列相似性法比NJ法具有更高的分辨率。

由于trnH-psbA有2份个体PCR扩增失败，本研究进一步利用matK＋rbcL＋ITS进行玉叶金花属植物条形码分析。基于该组合片段的NJ树共成功鉴定了15个种，分辨率为75%，其中包括2个药用种类广西玉叶金花和黐花（图 1）。未能成功鉴定的共5个种，包括2个药用种类玉叶金花和白花玉叶金花以及3个非药用种类广东玉叶金花、海南玉叶金花和疏花玉叶金花。除广西玉叶金花的支持率为52%，其他鉴定成功种类的支持率均在60%以上。此外，狭域分布的种类大多被成功鉴定。例如，5个云南特有种贡山玉叶金花、狭瓣玉叶金花、红毛玉叶金花、多脉玉叶金花和壮丽玉叶金花，1个海南特有种洋玉叶金花，以及1个广西特有种仁昌玉叶金花均被成功鉴定。从NJ树上来看，广东玉叶金花、海南玉叶金花、玉叶金花和白花玉叶金花聚在一支，与壮丽玉叶金花和广西玉叶金花遗传距离较近。

图 1 基于matK＋rbcL＋ITS条形码数据的玉叶金花属NJ树Fig. 1 Neighbor-joining tree based on matK + rbcL + ITS combined for species ofMussaenda L.

DNA条形码是用于区分植物近缘类群、鉴定药用植物的有效手段。植物叶绿体量丰富，即使从植物标本中提取DNA也能成功用于叶绿体片段扩增。叶绿体基因组单亲遗传，避免了基因重组，使其成为了植物DNA条形码的主要来源^{[9, 28]}。然而，仅仅依靠叶绿体基因组的信息尚不足以解决物种鉴定问题，叶绿体基因组与核基因组片段相组合的条形码更具有物种鉴别能力^{[18, 29, 30]}。本研究中，无论是利用序列相似性法还是NJ树法，单一片段条形码的分辨率均≤50%，而片段组合的条形码分辨率明显提高（表 3）。基于本研究，核心条形码matK＋rbcL比单一叶绿体片段条形码具有更高的分辨率，但仍不足以进行物种鉴定研究。在核心条形码基础上，增加候选条形码ITS片段比trnH-psbA片段可获得更高的分辨率（表 3）。ITS2被证明为药用植物有效的DNA条形码，本研究结果也表明ITS2比ITS具有更高的分辨率。但是，ITS2单一片段条形码尚不足以解决玉叶金花属物种鉴定的问题（表 3）。同时，在组合片段中，ITS2参与组合的条形码，其分辨率低于ITS参与组合的条形码。因此，建议仍利用ITS作为候选条形码。基于序列相似性法和NJ法，matK＋rbcL＋ITS和matK＋rbcL＋trnH-psbA＋ITS 2种组合的结果相当，但是trnH-psbA的PCR扩增率较低。基于以上原因，建议PCR扩增容易、成功率高、分辨率高的matK＋rbcL＋ITS片段组合作为玉叶金花属近缘类群物种鉴定的DNA条形码。

玉叶金花属植物具有较高的药用价值和经济价值^[4]。利用该属植物开发、生产的中药产品也已在民间流传，如源吉林甘茶、玉叶清火片、玉叶解毒颗粒、玉叶解毒糖浆、三金感冒片和千金茶等^[6]。根据分类学和生药学研究报道，该属植物长期以来存在形态鉴定困难、药用种类难以鉴定等问题，对其药用植物的利用和开发造成影响。本研究成功鉴定了2个常见药用种类广西玉叶金花和黐花，在NJ树上明显区别于其他近缘类群。然而，2个常见药用种类玉叶金花和白花玉叶金花的个体与广东玉叶金花和海南玉叶金花聚在一起，无法成功鉴定。这4个种地理分布区域广，分布区重叠，在形态学上难以区分，可能存在种间杂交或基因渐渗，建议利用更多片段组合的条形码对其进行更加深入的研究和分析。此外，DNA条形码在鉴定云南、海南和广西的玉叶金花属植物中具有明显优势，共有7个地区性特有种被成功鉴定。这些地区是黎药和瑶药的重要产出地，但这些地区的玉叶金花属植物药用价值尚不明确，本研究结果将在其药用植物的开发和利用中具备一定的应用价值。