2015, Vol. 46
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.05.013 |
2. 嘉兴市食品药品检验所, 浙江 嘉兴 314050
2. Jiaxing Institute for Food and Drug Control, Jiaxing 314050, China
高血压病（hypertensive disease）既是一种以动脉血压持续升高为主要表现的常见病、多发病、慢性病，又是可引起脑中风、冠心病、肾功能衰竭的最危险因素。目前临床常用的降血压药按其作用可分为以下几大类[1]：①中枢性降压药；②肾上腺素受体阻断药；③影响交感神经递质的药物；④血管紧张素转换酶抑制药；⑤钙拮抗药；⑥周围血管扩张药；⑦利尿降压药，全部划归为处方药管理。因此，降血压药的使用有其严格的规定，需要在医生指导下使用，才能得到既控制血压，又减小毒害作用的目的。一些不法分子为使原本不具有快速降压疗效的中成药和保健食品通过违法添加化学药使其具有了速效、高效、特效等效果，再配合虚假广告宣传，让不明真相的消费者上当受骗，以获取高额利润。
目前中药及保健食品中添加问题比较突出[2]，国家食品药品监督管理局颁布了针对降压类中成药中非法添加西药的《药品检验补充方法和检验项目批准件》（批准件编号2009032），适用于降压类中成药及调节血压类保健食品中非法添加阿替洛尔等7种化学药品的筛查和验证。
目前，对降压类中成药及保健食品中违法添加某一类降血压药研究的多[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]，同时对几大类降血压药进行研究的报道少[10, 11]，文献报道方法主要有TLC法[12]、HPLC法[13, 14]、GC-MS法[15]、HPLC- MS/MS法[16, 17]。本实验选择了上述7大类临床常用的化学降压药，适当增加一些新型的降压药，确定34种常用化学降压药为目标物，采用UPLC-MS/MS方法，以多离子反应监测（MRM）为测定模式，建立了多通道实时定性和定量检测降压类中成药及调节血压类保健食品中非法添加化学药的方法，可在22 min内同时准确检测出胶囊剂、片剂、丸剂3种剂型中违法添加的34种化学降压药，大大提高了检测效率，为新形势下的药品和保健食品的质量提供了强有力的技术保障。
1 仪器与材料Acquity UPLC型超高效液相色谱仪、Quattro Premiere XE型三重四极杆串联质谱仪、电喷雾离子化源（ESI）、MassLynx数据处理系统（美国Waters公司）；Mili-Q超纯水器（美国密理搏公司）；Sartorius BP211D型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］，USC-502型超声波清洗器（上海波龙电子有限公司）。
对照品盐酸可乐定（批号100071-201106）、卡托普利（批号100318-201103）、利血平（批号100041- 200311）、甲基多巴（批号100189-199501）、氢氯噻嗪（批号100309-201103）、呋塞米（批号100544- 201102）、吲达帕胺（批号100257-201204）、米诺地尔（批号100238-199701）、盐酸肼屈嗪（批号100263-200301）、阿替洛尔（批号100117-200504）、赖诺普利（批号100814-200701）、盐酸地巴唑（批号100420-200301）、酒石酸美托洛尔（批号100084- 200101）、富马酸比索洛尔（批号100711-200401）、盐酸哌唑嗪（批号100164-200402）、盐酸特拉唑嗪（批号100375-200502）、盐酸普萘洛尔（批号100783- 200401）、马来酸依那普利（批号100705-200401）、盐酸喹那普利（批号100568-200401）、盐酸贝那普利（批号100768-200501）、盐酸地尔硫卓（批号100161-200503）、甲磺酸多沙唑嗪（批号100566- 200401）、盐酸尼卡地平（批号100586-200401）、硝苯地平（批号100338-0001）、苯磺酸氨氯地平（批号100374-200602）、尼莫地平（批号100270- 200002）、非洛地平（批号100717-200501）、尼群地平（批号100585-200602）、尼索地平（批号100717- 200501）、缬沙坦（批号100651-200401）、替米沙坦（批号100629-201202）、坎地沙坦酯（批号100685- 200401）、厄贝沙坦（批号1200607-201202）、奥美沙坦酯（批号100864-200601）均购自中国食品药品检定研究院，以上对照品均供定量测定用。实测样品主要购自各大药店和网购样品，部分为市、县食品药品监督管理局及公安机关抽检的样品如双清降压活性肽胶囊（保健品）、玉竹昆布胶囊（保健品）、新乐压肽天清软胶囊（保健品）、平压乐TM依欣胶囊（保健品）等。试剂甲醇（德国Merck公司）、甲酸（美国Tedia公司）均为色谱纯，其余试剂均为国产分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 UPLC色谱条件色谱柱为Waters Acquity BEH-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸甲醇溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～5 min，32% A；5～8 min，32%～50% A；8～12 min，50% A；12～14 min，50%～60% A；14～16 min，60%～80% A；16～18 min，80% A；18～19 min，80%～90% A；19～20 min，90%～100% A；20～21 min，100% A；21～22 min，100%～32% A。体积流量0.2 mL/min；柱温为40 ℃；进样量5 μL。
2.2 MS/MS质谱条件毛细管电压3.0 kV；二级锥孔电压（Extractor）：3 V；六级杆透镜电压（RF Len）：0 V；离子源温度110 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流量650 L/h；锥孔反吹气流量50 L/h；碰撞气压力320 Pa；选择MRM采集碎片离子信号。因药物数量多，化学性质差异大，为提高检测灵敏度和定量准确性，按色谱流出时间将34种化学药分为6组，分别对各时间段内流出物质的定性和定量离子进行质谱扫描，各物质的准分子离子峰、主要子离子碎片峰及其质谱数据采集参数见表 1。
|
表 1 34种降压类化学药物的质谱采集参数 Table 1 LC-MS/MS parameters for 34 kinds of chemical hypotensors |
精密称取上述34种对照品各10 mg，分别置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇适量超声溶解，放冷，用甲醇稀释至刻度，制成质量浓度均为1 mg/mL的对照品储备液。再精密量取适量，用50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）定量稀释成质量浓度均为200 ng/mL的混合对照品溶液。其中多个对照品为与酸成盐的形态，定量计算以盐计。
2.3.2 供试品溶液取胶囊剂样品的内容物、片剂以及丸剂各适量，分别置于研钵中，研磨均匀成粉末状。分别精密称取粉末0.5 g，置50 mL量瓶中，加甲醇溶液约40 mL，超声处理15 min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀后初滤，再取续滤液经0.22 μm微孔滤膜滤过，作为供试品储备液。精密量取上述供试品储备液适量，用流动相按比例逐步稀释成与对照品溶液质量浓度相近的溶液，作为供试品溶液。
2.3.3 阴性样品溶液取胶囊剂、片剂、丸剂3种剂型具有代表性的阴性样品各2份，按上述方法分别制成胶囊剂、片剂、丸剂的空白基质粉末，分别称取1.0 g，置于100 mL量瓶中与供试品溶液同法制备3种剂型的阴性样品溶液。
2.4 34种降压类化学药的色谱及质谱特性按照“2.1”和“2.2”项下色谱、质谱条件进样，分别测定了34种化学药的一组定性离子和一组定量离子，其中呋塞米为一组定量离子，共安排67个离子监测通道。为了保证定量分析的准确性，要求对色谱流出峰质谱定量满足采集15个点以上。为此，本方法将整个色谱分离时间（22 min）分成6个MRM采集时间段，可以确保各物质均有足够的质谱扫描采集点。各质谱采集时间段的MRM总离子流图见图 1。由图 1可知，由于化合物数量较多，第1时间段内有甲基多巴、阿替洛尔、盐酸肼屈嗪色谱峰之间未完全分离；第3时间段内有马来酸依那普利、盐酸普萘洛尔、吲达帕胺色谱峰之间未完全分离；第4时间段内有盐酸地尔硫卓、甲磺酸多沙唑嗪色谱峰之间，奥美沙坦酯、盐酸贝那普利色谱峰之间未完全分离；第5时间段内有利血平、硝苯地平色谱峰之间，苯磺酸氨氯地平、盐酸喹那普利、厄贝沙坦色谱峰之间及缬沙坦、尼群地平色谱峰之间未完全分离。由图 2可知，在MRM模式下，保留时间相近的上述各化学药均能达到完全分离，各通道之间无明显干扰。
 | 图 1 34种降压类化学药的总离子流色谱图 Fig. 1 TIC of 34 kinds of chemical hypotensors |
 | 图 2 34种化学药对照品定量离子对的MRM色谱图 Fig. 2 MRM chromatograms of quantitative ion pairs for 34 kinds of chemical reference substances |
取“2.3.3”项下3种阴性样品溶液各5 μL，按“2.1”和“2.2”项下色谱、质谱条件进样测定，所得到的3种剂型阴性样品溶液的总离子流图（TIC）和MRM色谱图，均未见有干扰34种目标化学药成分的色谱峰。结果显示，3种剂型中所含的中药成分均不干扰目标物的测定，方法专属性强。
2.6 线性范围考察与检测限和定量限试验精密量取“2.3.1”项下制备的对照品储备液，根据各物质离子化效率的不同，分别用50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）定量稀释成含盐酸地巴唑、甲磺酸多沙唑嗪、盐酸喹那普利、盐酸贝那普利、盐酸哌唑嗪、替米沙坦、盐酸普萘洛尔、马来酸依那普利、甲基多巴、盐酸肼曲嗪、富马酸比索洛尔、盐酸尼卡地平、盐酸地尔硫卓、厄贝沙坦、硝苯地平、利血平、坎地沙坦酯质量浓度为3、7.5、15、37.5、75、150、300 ng/mL；苯磺酸氨氯地平、盐酸特拉唑嗪、酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、米诺地尔、坎地沙坦酯、奥美沙坦酯、吲达帕胺、坎地沙坦酯、非洛地平、硝苯地平、缬沙坦、尼索地平、赖诺普利、呋塞米质量浓度为5、12.5、25、62.5、125、250、500 ng/mL；卡托普利、盐酸可乐定质量浓度为12.5、25、62.5、125、250、500 ng/mL；氢氯噻嗪质量浓度为25、62.5、125、250、500、1 000 ng/mL的混合对照品溶液。按“2.1”和“2.2”项下色谱、质谱条件进样测定，以各化学药的定量监测离子对的色谱峰峰面积为纵坐标（Y），对应的进样质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，进行线性回归得线性方程和相关系数（r）见表 2。结果表明34种化学药在各自的质量浓度范围内（3～300 ng/mL，5～500 ng/mL，12.5～500 ng/mL和25～1 000 ng/mL）与色谱峰峰面积均呈良好线性关系，r均大于0.990 0。
|
|
表 2 34种化学降压药的线性方程、相关系数、回收率、精密度及LOD、LOQ Table 2 Linear equation,correlation coefficient,recovery rates,precision,LOD,and LOQ for 34 kinds of chemical hypotensors |
取阴性样品（心可舒胶囊，重庆希尔安药业有限公司），按0.5 mg/g的添加量加入混合对照品溶液，经适当稀释后进样，以信噪比为3时计算各化学药的检测限（LOD）和信噪比为10时的定量限（LOQ），结果见表 2，LOQ均在1.5 ng/g以下，表明方法具有较高的灵敏度，完全能满足非法添加化学药的检测要求。
2.7 进样精密度试验取200 ng/mL混合对照品溶液5 μL，按“2.1”和“2.2”项下色谱、质谱条件进样测定，连续测定6次，计算上述34种化学药定量离子对质谱峰面积的RSD在0.93%～6.7%（n＝6），见表 2。表明方法的精密度良好。
2.8 重复性试验取阴性供试品溶液共6份，分别精密加入对照品储备液适量，使含各种化学药质量浓度均为0.5 mg/g，按“2.3.2”项下方法进行提取后，按“2.1” 和“2.2”项下色谱、质谱条件进样测定，计算各成分的量及其RSD。结果卡托普利、甲基多巴、盐酸肼曲嗪、赖诺普利、阿替洛尔、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、米诺地尔、盐酸特拉唑嗪、盐酸哌唑嗪、酒石酸美托洛尔、盐酸地巴唑、马来酸依那普利、吲达帕胺、呋塞米、富马酸比索洛尔、盐酸普萘洛尔、奥美沙坦酯、盐酸尼卡地平、甲磺酸多沙唑嗪、盐酸贝那普利、盐酸地尔硫卓、厄贝沙坦、苯磺酸氨氯地平、硝苯地平、尼群地平、利血平、替米沙坦、盐酸喹那普利、缬沙坦、坎地沙坦酯、尼索地平、非洛地平、尼莫地平的平均质量分数分别为0.49、0.45、0.48、0.50、0.51、0.48、0.42、0.51、0.48、0.50、0.51、0.49、0.48、0.42、0.45、0.49、0.49、0.49、0.50、0.47、0.49、0.49、0.50、0.49、0.49、0.43、0.48、0.52、0.48、0.49、0.60、0.44、0.49、0.43 mg/g（n＝6）；RSD分别为3.3%、5.9%、5.6%、4.6%、3.0%、6.0%、5.6%、2.8%、5.7%、1.3%、2.5%、2.2%、3.7%、5.7%、6.8%、2.4%、3.5%、3.1%、1.9%、2.9%、3.5%、3.4%、3.0%、1.9%、2.7%、4.5%、2.1%、4.3%、3.0%、4.2%、2.8%、3.6%、3.2%、4.1%（n＝6），表明该方法重复性较好。
2.9 稳定性试验取重复性试验项下一份供试品溶液（各化学药质量浓度均为200 ng/mL），分别在配制后避光放置0、2、4、6、8、12 h，依法测定。根据上述34种化学药的定量离子对色谱峰面积计算其RSD，结果均在1.6%～4.8%（n＝6），表明供试品溶液12 h内稳定。
2.10 加样回收率试验与精密度试验精密称取不含34种化学药的阴性胶囊剂（心可舒胶囊、山菊降压胶囊）、片剂（清脑降压片、复方羚角降压片）、丸剂样品（降压丸）的空白基质各9份，每份称取0.5 g，各分3组，分别置于100 mL量瓶中，加入混合对照品溶液各适量，同“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照各化学药物的质谱响应，将34种化学药分为3组，其中盐酸地巴唑、甲磺酸多沙唑嗪、盐酸喹那普利、盐酸贝那普利、盐酸哌唑嗪、替米沙坦、盐酸普萘洛尔、马来酸依那普利、盐酸肼曲嗪、富马酸比索洛尔、盐酸尼卡地平、盐酸地尔硫卓、厄贝沙坦进行0.5、1.0、2.0 mg/g，苯磺酸氨氯地平、盐酸特拉唑嗪、酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、米诺地尔、卡托普利、坎地沙坦酯、奥美沙坦酯、吲达帕胺、甲基多巴、利血平、尼莫地平、尼群地平进行0.8、1.6、3.2 mg/g，非洛地平、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、硝苯地平、缬沙坦、尼索地平、赖诺普利、呋塞米进行1.2、2.4、4.8 mg/g 3个添加水平的回收率试验。结果见表 2。从表 2可见，34种化学药的标准加样回收率，各质量浓度的平均回收率均在80%～120%，达到比较满意的结果。
日内精密度和日间精密度均采用添加水平为0.5 mg/g的空白样品，按“2.3.2”项下方法进行提取后，按“2.1”和“2.2”项下色谱、质谱条件进样测定，日内精密度由重复实验6次测定得到，日间精密度由连续3 d重复取样测定得到。结果，日内精密度的RSD控制在1.8%～6.5%，日间精密度的RSD控制在1.9%～10.3%，表明方法精密度良好。
 | A1-217.9→70.1 A2-217.9→116.1 B1-347.2→254.2 B2-347.2→194.8 C1-409.1→238.1 C2-409.1→294.2 D1-361.0→315.3 D2-361.0→329.3 E1-296.0→269.2 E2-296.0→205.2 F1-377.2→234.2 F2-377.2→129.7图 3 对照品 (I) 及样品 (II) 溶液中卡托普利 (A)、硝苯地平 (B)、苯磺酸氨氯地平 (C)、尼群地平 (D)、氢氯噻嗪 (E) 和马来酸依那普利 (F) 的MRM定量 (1)、定性 (2) 离子对色谱图 Fig. 3 MRM chromatograms of qualitative (1) and quantitative (2) for ion pairs of captopril (A),nifedipine (B),amlodipine besylate (C),nitrendipine (D),hydrochlorothiazide(E),and enalapril maleate (F) in reference substances (I) and samples (II) |
本次研究共收集降压类中成药及保健食品17批，取各品种样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”、“2.2”项下色谱、质谱条件分别进样测定，根据定量监测离子对的色谱峰面积，采用外标法计算样品中各化学药的量。共检测降压类中成药及调节血压类保健食品17批次（包括胶囊、片剂、丸剂等不同基质类型）。结果表明，12批降压类中成药中均未检出添加化学药，5批调节血压类保健食品中检出4批添加了化学药，阳性率为80%，典型的MRM色谱图见图 3。样品中检出卡托普利、尼群地平、苯磺酸氨氯地平、氢氯噻嗪、马来酸依那普利和硝苯地平。样品中药物添加的质量浓度为0.5～137.7 mg/g，结果见表 3。
|
|
表 3 样品信息及检出成分 (n = 3) Table 3 Sample information and detected components (n = 3) |
本方法将快速初筛技术、验证技术和准确定量统一结合，既节省了大量的人力物力，又极大地提高了非标检测工作的效率，一次进样即可获得67个通道采集的质谱信息，根据色谱保留时间即可判断样品中是否添加了34种化学药物。该方法建立了一个操作简便、适用范围广、灵敏度高、准确、快速的高通量多成分检测平台，对34个化学药物分6个时间段进行质谱扫描，大大提高了定量准确性。不仅适用于丸剂、片剂和胶囊剂样品中添加了化学降压药的准确检测，也适用于其他剂型保健品和中成药样品的快速筛查。由于中成药成分复杂，添加化学物质不易被识别，且降压类中成药及保健品中可能添加的化学药成分品种也越来越多，需要不断加以研究以适应现实检测的需要，为药品监管及规范保健品市场提供技术支撑，对维护消费者的切身利益，具有非常重大的意义。
| [1] | 陈新谦, 金有豫, 汤 光. 新编药物学 [M]. 第17版. 北京: 人民卫生出版社, 2011. |
| [2] | 朱 健, 裘一婧, 沈国芳. 中药中非法添加问题研究现状与分析 [J]. 中草药, 2014, 45(3): 437-442. |
| [3] | 谢清萍. 中成药中可能违禁添加6种化学降压药物的HPLC法测定 [J]. 中国医药工业杂志, 2010, 41(6): 450-452. |
| [4] | 李杨杰, 欧国灯, 李泳雪. HPLC-MS-MS法测定降压类中成药和保健食品中非法添加氨氯地平和乐卡地平的研究 [J]. 中成药, 2013, 35(5): 956-960. |
| [5] | 田 兰, 张继春, 陈 睿. UPLC-MS/MS法检测降压类中药制剂及保健品中添加的化学药品 [J]. 中国药师, 2013, 16(1): 46-49. |
| [6] | 程爱平, 欧贝丽, 章展煌. UPLC. MS/MS法测定中成药制剂中添加的11种降压药物 [J]. 海峡药学, 2011, 23(7): 63-66. |
| [7] | 吴嫣艳, 曹 玲, 丁安伟. 降压保健食品中非法添加氢氯噻嗪的检测 [J]. 南京中医药大学学报, 2011, 27(1): 92-94. |
| [8] | 张西如, 姜建国. 应用液相色谱-质谱联用技术检测中药降压制剂中掺入的尼莫地平 [J]. 中国药业, 2009, 18(19): 28-29. |
| [9] | 李望云, 张 静, 吕情花. 降压类保健食品中非法添加的氢氯噻嗪与氨苯蝶啶的检查 [J]. 中南药学, 2012, 10(8): 586-588. |
| [10] | 孙夏荣, 李 丹, 文红梅. 中成药与保健食品中违禁添加的20种降压类化学药物的LC-MS/MS法检测 [J]. 中国医药工业杂志, 2011, 42(12): 941-944. |
| [11] | 张 燕, 杨 钊, 朱润洁, 等. UPLC-MS/MS测定降压类中成药及保健品中30种化学药 [J]. 中国药学杂志, 2012, 47(2): 141-145. |
| [12] | 王铁松, 仝 禹, 郑 洁. 薄层色谱法快速筛查降脂、降压、止咳平喘类中药制剂中的29种添加化学药物 [J]. 中国药学杂志, 2010, 45(11): 857-861. |
| [13] | 胡 青, 张 甦, 王 柯, 等. 中药及保健食品中违禁添加7种降压类化学药物的HPLC-DAD法测定 [J]. 中国现代应用药学, 2010, 41(8): 601-603. |
| [14] | 刘吉金, 杨 敏, 李 军, 等. HPLC同时检测保健品及中成药中非法添加9种抗高血压化学药物的研究 [J]. 中国现代应用药学, 2008, 25(8): 717-719. |
| [15] | 李 涛, 朱小红, 林 芳. GC-MS联用方法检测降压类中成药及保健食品中非法添加的化学药物 [J]. 药物分析杂志, 2010, 30(11): 2212-2215. |
| [16] | 赵 勇, 朱慧果, 吴 双, 等. HPLC-MS联用测定辅助降血压保健食品中添加钙通道阻滞剂类药物 [J]. 药物分析杂志, 2013, 33(7): 1141-1150. |
| [17] | 鲁 艺, 邱颖妲, 陈平平, 等. 降压类保健食品及中成药中添加化学药品的液相色谱-质谱联用测定方法研究 [J]. 药物分析杂志, 2010, 30(10): 1913-1917. |