分子印记技术（molecularly imprinted technique，MIT）是以目标分子为模板分子，将结构上与模板分子互补的聚合物单体通过共价或非共价键与模板分子结合，再加入交联剂进行聚合反应，反应结束后采用物理或化学方法将模板分子除去，形成一种具有固定空穴大小、形状并有确定排列功能团的对模板分子具有特殊吸附选择性的交联高聚物，即分子印记聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）^{[1, 2]}。由于MIPs具有预定性、识别性和实用性三大特性^[3]，并且具有抗恶劣环境能力强、稳定性高和使用寿命长等优点，目前已被广泛应用于色谱分离^[4]、固相萃取^[5]、生物传感器^[6]、膜分离^[7]、模拟酶催化^[8]等方面，尤其在中药成分分离检测中的应用令人瞩目。

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎^[9]，具有显著的扩张冠脉、改善微循环、保护心脏等作用^{[10, 11, 12, 13]}，是临床常用的活血化瘀中药之一，并开发出滴丸、注射剂等新剂型^[14]。现有的很多研究表明丹参酮II_A（tanshinone II_A，TSII_A）是丹参中主要活性成分之一。许多研究报道表明TSII_A具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎等多方面的作用^[13]。因此，TSII_A的分离纯化和提取浓缩已受到国内外的广泛关注。本研究将以TSII_A为模板分子合成MIPs，并采用光谱和计算机模拟技术对分子印记的过程和机制进行研究，以期利用MIPs对模板分子的高亲和力和高选择性吸附性能，实现对目标分析物的高效富集，为药材和生物样品中丹参酮II_A的分离和检测提供高灵敏度、专一的新方法。

LC-10ATvp高效液相色谱仪、UV 2450紫外分光光度计，日本岛津公司；Vortex genius 3旋涡混匀器，德国IKA公司；ZHLY-180型振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；KQ5200超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Gaussian98，Inc. Carnegic Office Park,Bldg.6 Pittaburgh，PA 15106美国。

TSII_A对照品，质量分数98%，批号20080624，江苏朗泽生物科技有限公司；正硅酸四乙酯（TEOS），国药集团化学试剂有限公司；3-(异丁烯酰氧) 丙基三甲氧基硅烷（MPS），质量分数97%，阿拉丁试剂公司；甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酰胺（AAM），国药集团化学试剂有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA），美国Sigma公司；偶氮二异丁腈（AIBN），Aladdin公司，并于使用前进行重结晶纯化；甲醇，西陇化工股份有限公司；冰醋酸，南京化学试剂有限公司；甲苯，上海凌峰化学试剂有限公司；氨水，西陇化工股份有限公司。

选择合适的功能单体，使模板分子TSII_A和功能单体之间有较强的相互作用，以便在聚合物中形成对模板分子具有选择性识别位点的结构。因此，在量子化学计算机模拟研究中，所选择的功能单体，其结构上均须具有可形成弱相互作用力或氢键的基团，因此本实验选择非共价分子印记研究中最常用的2种功能单体MAA和AAM为研究对象。

计算机模拟分为2步：第1步，根据所选功能单体的特点，首先在Gaussian view软件中建立分子结构模型，然后利用计算软件Gaussian 98对所构建的分子结构进行优化，并对模板分子和各功能单体分子进行Mulliken电荷分析，经HF/6-31G (d,p) 软件优化的TSII_A、MAA及AAM结构见图 1，相应的Mulliken电荷（eV）计算结果如下：TSII_A（C₁₉H₁₈O₃）C₁: -0.238 065、C₂: -0.202 698、C₃: -0.091 783、C₄: 0.002 090、C₅: -0.001 485、C₆: -0.187 765、C₇: -0.130 195、C₈: -0.133 572、C₉: -0.039 571、C₁₀: -0.143 428、C₁₁: 0.385 039、C₁₂: -0.182 473、O₁₃: -0.611 668、C₁₄: 0.123 624、C₁₅: -0.012 285、C₁₆: 0.462 055、O₁₇: -0.492 987、C₁₈: 0.506 093、O₁₉: -0.516 109、C₂₀: -0.304 212、C₂₁: -0.294 429、C₂₂: -0.314 574、H₂₃: 0.126 230、H₂₄: 0.115 703、H₂₅: 0.118 114、H₂₆: 0.117 454、H₂₇: 0.151 089、H₂₈: 0.151 953、H₂₉: 0.161 492、H₃₀: 0.189 358、H₃₁: 0.180 282、H₃₂: 0.116 151、H₃₃: 0.122 878、H₃₄: 0.106 233、H₃₅: 0.113 665、H₃₆: 0.119 802、H₃₇: 0.110 236、H₃₈: 0.118 640、H₃₉: 0.151 071、H₄₀: 0.148 048；MAA（C₄H₆O₂）C₁: -0.093 059、C₂: -0.253 369、O₃: -0.609 585、C₄: 0.776 932、O₅: -0.574 983、C₆: -0.325 567、H₇: 0.140 276、H₈: 0.178 187、H₉: 0.362 460、H₁₀: 0.121 055、H₁₁: 0.138 827、H₁₂: 0.138 827；AAM（C₃H₅NO）C₁: -0.223 009、C₂: -0.229 883、N₃: -0.766 930、C₄: 0.746 217、O₅: -0.616 463、H₆: 0.137 229、H₇: 0.141 671、H₈: 0.180 848、H₉: 0.320 845、H₁₀: 0.309 476。

图 1

Fig. 1

图 1 经HF/6-31G (d, p) 软件优化后的TSIIA (A)、MAA (B)、AAM (C) 结构 Fig. 1 Structure of optimized TSIIA (A),MAA (B),and AAM (C) at HF/6–31G (d,p) level

第2步，使用pm3量子化学计算方法计算各构象的能量，模板与单体的相互作用能利用下式表示：

单体与模板的结合能越大，它们之间越容易形成氢键，而且形成的氢键越牢固，形成的聚合物结合力越强，从而达到选择合适的功能单体的目的。同时，计算机模拟还可以推测模板与单体结合时的结合位点、空间构象以及反应物质的量比，从而协助对分子印记的机制和规律进行研究。

由TSII_A的化学结构特点可知，理论上TSII_A分子结构中存在3个可以形成氢键的结合位点，并且Mulliken电荷分析同样证实TSII_A的羰基氧原子（O₁₇: -0.492 987 eV、O₁₉: -0.516 109 eV）、呋喃环氧原子（O₁₃: -0.611 668 eV）可形成氢键，且均为质子接受体，因此选用了MAA、AAM等含质子给予体、非共价分子印记常用功能单体，可形成O···H-O、O···H-N型氢键。

在进行模板分子-功能单体相互作用的量子化学计算机模拟时，分别选择模板分子（TSII_A）与功能单体（MAA、AAM）比例为1∶1、1∶2和1∶3 3种计算模型来进行研究。经HF/6-31G (d，p) 软件优化的模板分子-功能单体1∶1、1∶2及1∶3比例结构（图 2），相应的模板、单体、复合物的能量（E）及结合能（ΔE）计算结果见表 1。

图 2

Fig. 2

图 2 经HF/6-31G (d, p) 软件优化的模板分子-功能单体不同比例结构图 Fig. 2 Structure of optimized template-functional monomer with different molar ratios at HF/6-31G (d,p) level

根据能量越低体系越稳定的基本原理，从表 1中可以看出，不同比例模板分子-功能单体复合物同AAM相比，TSII_A与MAA均具有较强的相互作用，且随着MAA分子数目的增加，ΔE不断降低，相互作用逐渐增强，因此计算结果表明MAA较AAM更适合作为合成TSII_A MIPs的功能单体。

表 1(Table 1)

表 1 pm3计算的模板分子、功能单体及相应不同比例复合物的结合能 Table 1 Binding energy of template molecule,functional monomer,and different molar ratios of template-functionalmonomercalculated by pm3 模板、单体及复合物 E/(a.u.) ΔE/(kJ∙mol-1) TSIIA -954.598 452 00 - MAA -304.707 054 641 - AAM -245.833 527 29 - TSIIA-MAA（1∶1） -1 446.283 792 77 -29.948 236 77 TSIIA-AAM（1∶1） -1 200.441 728 73 -25.597 155 62 TSIIA-MAA（1∶2） -1 564.033 876 12 -55.962 109 14 TSIIA-AAM（1∶2） -1 446.283 792 77 -48.010 217 10 TSIIA-MAA（1∶3） -1 868.755 155 47 -93.308 741 03 TSIIA-AAM（1∶3） -1 692.123 611 21 -64.527 571 31 1 a.u.＝2 625.499 748 kJ/mol

表 1 pm3计算的模板分子、功能单体及相应不同比例复合物的结合能 Table 1 Binding energy of template molecule,functional monomer,and different molar ratios of template-functionalmonomercalculated by pm3

计算机模拟还可以推测模板与单体结合时的物质的量比，模板TSII_A与不同个数（1、2、3、4）MAA形成复合物的结合能分别为-29.864 8、-55.787 4、-93.877 0、-105.654 0 kJ/mol。可以看出随着MAA的加入，复合物的结合能也增加，但是当第4个MAA分子加入时，复合物结合能却没有明显的增加，这表明分子印记过程中1个TSII_A分子是和3个MAA分子结合的，第4个MAA不参与体系氢键。实验中TSII_A与MAA按1∶4的比例加入反应体系，是为了使MAA过量，加速反应进程。

实验采用改进的Stober-Fink-Bohn法，以TEOS为前体，氨水为催化剂，乙醇为溶剂，采用溶胶-凝胶法（sel-gel process）制备纳米二氧化硅（silica nanoparticles，nanoSiO₂）。室温下将2.8 mL浓氨水、3.1 mL TEOS和1.3 mL蒸馏水快速加入高速磁力搅拌的100 mL无水乙醇溶液中，转速为500 r/min，磁力搅拌24 h；用无水乙醇反复超声洗涤至中性、离心，40 ℃下真空干燥至恒定质量，制得约2.0 g单分散nanoSiO₂颗粒^[15]。溶胶-凝胶法制备nanoSiO₂反应过程如下：

Si(OC₂H₅)₄＋4H₂O→Si(OH)₄＋4C₂H₅OH nSi(OH)₄→nSiO₂＋2nH₂O

如图 3，称取制得的SiO₂颗粒0.5 g超声分散于50 mL甲苯中，加入7.5 mL MPS，磁力搅拌下通N₂除氧，转速500 r/min。55 ℃下搅拌回流24 h，然后用甲苯、甲醇超声洗涤，离心，除去未反应的MPS，在40 ℃下真空干燥12 h，备用，制得约0.5 g nanoSiO₂-MPS^[16]。

图 3

Fig. 3

图 3 纳米二氧化硅表面修饰MPS Fig. 3 Modification of MPS at surface of nanoSiO2

由图 4可见，b曲线同a、c曲线相比，可以看到1 721 cm^-1为MPS的酯羰基吸收峰，2 899 cm^-1为MPS的甲基C-H伸缩振动吸收峰，结果表明MPS成功接枝到nanoSiO₂表面，为芯壳纳米MIPs合成奠定了基础。

图 4

Fig. 4

图 4 NanoSiO2 (a)、nanoSiO2-MPS (b) 和MPS (c) 的FT-IR图谱 Fig. 4 FT-IR spectra of nanoSiO2 (a),nanoSiO2-MPS (b),and MPS (c)

称取2份nanoSiO₂-MPS 0.100 g，分别溶于25 mL甲苯溶剂，超声30 min，转移至100 mL三颈瓶中，加入模板分子TSII_A 109.0 mg，引发剂AIBN 66.0 mg，交联剂EGDMA 1.104 g，甲苯25 mL，再分别加入功能单体MAA 95.0 μL（模板分子和功能单体的物质的量比为1∶4）、功能单体AAM 0.114 mg，常温下搅拌30 min，转速750 r/min，N₂保护下在密闭环境中50 ℃反应6 h，升温60 ℃反应24 h，再升温至85 ℃反应6 h。将产物离心，除去上清液，加甲苯超声离心洗脱3次，甲醇洗脱1次，加甲醇-冰醋酸（9∶1）超声30 min，摇床2 h后离心洗脱9次，再使用甲醇洗脱3次，直至上清液紫外检测不到模板分子为止。然后40 ℃真空干燥至恒定质量，得到芯-壳结构、有机无机杂交的MIPs微球。

非印记聚合物（NIPs）的制备过程，除在合成过程中不添加模板分子TSII_A以外，其余步骤和MIPs相同。

在10 mL浓度为0.05 mmol/L的TSII_A乙腈溶液中，渐增MAA的浓度（0～1.5 mmol/L），混合溶液静置4 h，以相应的MAA溶液作空白，测定混合溶液的紫外吸收光谱，并绘制差示紫外吸收光谱。

模板分子-功能单体之间的相互作用研究主要通过差示紫外吸收光谱的测定，求得主客体复合物的结合比。采用物质的量比法，即固定1个组分的浓度不变，改变另1组分的浓度，根据Lamber-Beer定律，求得模板分子TSII_A和功能单体MAA之间的结合比。由图 5可见，随着MAA浓度的增加（C_MAA/C_TSIIA＝1～5），TSII_A吸收光谱中特征吸收峰（270 nm处）吸光度逐渐增强，这表明MAA羧基中的羟基与TSII_A上的羰基或呋喃环氧原子通过氢键作用力发生了自组装，形成了较稳定的复合物，所以其光谱性质发生了显著的变化。理论上讲，模板分子TSII_A同功能单体MAA形成复合物的过程可以用下式表示：

T为模板分子，M为功能单体，K为结合常数，n为个数（n＝1，2，3……）。

图 5

Fig. 5

图 5 TSIIA与不同浓度MAA混合物的紫外光谱 Fig. 5 UV spectra of mixture of TSIIAand MAAat different concentration

当MAA的浓度（b₀）远大于TSII_A的浓度（a₀），复合物的浓度（c）可以通过下式计算：

（3）式中K为下述平衡的结合常数。

选择功能单体M无吸收的波长测定吸光度（A）值，则T的A值可用下式计算：

l为紫外光在样本溶液中经过的距离，ε_A和ε_C分别为A、C的物质的量吸光系数。当b₀＝0时（即不加入功能单体），上式变为：

则吸光度差值（ΔA）可以由下式计算：

其中，Δε＝ε_C－ε_A，将式（7）代入式（3）可得式（8）：

其中，n代表了复合物的组成（结合的数量），可取简单正整数，n＝1，2，3…；以ΔA/b₀ⁿ对ΔA作图，结果发现n＝3时为一良好直线（图 6），其回归方程为y＝-22.02 x＋1.206，R²＝0.995 5，说明TSII_A和MAA之间理论上主要形成1∶3型氢键配合物，这和计算机模拟的结果一致。从紫外光谱和计算机模拟的结果中发现分子印记过程中TSII_A和MAA主要以1∶3的比例形成复合物，在本实验中TSII_A和MAA按1∶4比例加入反应体系是为了使MAA过量，加速反应进程。

图 6

Fig. 6

图 6 ΔA/b03对ΔA作图 Fig. 6 Relationship between ΔA/b03 and ΔA

本实验把纳米技术、表面分子印记，计算机模拟和光谱技术结合起来，通过分子组装设计、纳米功能化等手段，以TSII_A为模板分子，分别以MAA和AAM为功能单体合成了对TSII_A具有高选择性和高分离效率的芯-壳结构复合纳米印记聚合物。首先该复合印记聚合物集合了有机物和无机物的优点，不仅有一定的刚性，而且模板分子的去除和目标分子的再结合也变得容易；其次芯-壳结构使得识别位点建立在聚合物微球表面，减少了识别位点被“包埋”的现象；然后，纳米结构赋予材料极大的比表面积，提高聚合物的吸附量。因此，合成的MIPs将对印记分子具有高度的亲和力和选择性，适合作为药物分离的原材料^{[1, 2]}。

近年来，随着计算机和量子化学理论的发展，计算机模拟的方法已经应用到MIPs体系，用以指导印记聚合物合成时单体的选择。本实验通过量子化学计算机模拟研究模板分子-功能单体间相互作用，表明MAA比AAM更适合合成印记聚合物，且模板分子-功能单体间理论最佳物质的量比为1∶3，从而协助对分子印记的机制和规律进行研究。

本实验利用紫外吸收差光谱研究了模板分子-功能单体之间的相互作用，发现1个TSII_A分子和3个MAA分子以氢键形式结合，形成稳定的复合物，与量子化学计算机模拟结果相一致。综上所述，成功合成的丹参酮II_A分子印记聚合物具有良好的选择性和亲和力，可能为从复杂样品中高效分离TSII_A提供一种新材料^{[15, 17]}。