杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv. 的干燥树皮，别名思仲、丝连木。《神农本草经》将杜仲列为上品，具有补中益精气、强筋骨、强志、安胎、久服轻身耐老之功效。主要用于治疗肾虚腰痛、筋骨无力、妊娠漏血、胎动不安、高血压症。杜仲的主要化学成分有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、多糖、氨基酸等有机化合物，其中京尼平苷、桃叶珊瑚苷属环烯醚萜类化合物，是由植物中臭蚁二醛衍生而来的一大类天然产物，具有保肝利胆、抗肿瘤、降低血压的功效；松脂醇二葡萄糖苷属木脂素类化合物，是一类在生物体内由双分子苯丙素生物聚合而成的化合物，具有降血压的功效，且降压作用持续、平稳、无不良反应；绿原酸属苯丙素类化合物，是形成木脂素的先导化合物，抑菌活性强^{[1, 2, 3]}。

国内外学者对杜仲药材活性成分分析检测研究报道较多^{[4, 5, 6, 7]}，但是大部分文献根据《中国药典》2010年版规定，偏重于测定杜仲叶中绿原酸^[8]或杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷量^{[9, 10]}。现代植物化学研究表明不同活性成分在杜仲板皮、枝皮分布有一定的差异，为更好地评价杜仲药材资源，使其天然活性成分在药品、健康制品应用领域得到充分的发挥和利用，同时为杜仲相关产品在生产中质量控制指标的多样性，本实验以杜仲板皮和枝皮为研究对象，建立HPLC法同时测定杜仲皮中环烯醚萜类、苯丙素类、木脂素类化合物中桃叶珊瑚苷、京尼平苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷4种主要成分，为有效控制杜仲药材的质量提供准确、迅速的检测方法，并为后续产品开发研究提供可靠的依据。

安捷伦LC-1260高效液相色谱仪，AUW220D型电子天平（十万分之一，日本岛津公司）；BS224S型电子天平（万分之一，Sartorius公司）；KQ250DB型数控超声波清洗器（巩义市予华仪器有限责任公司）；KQ5200型水浴锅（昆山市超声仪器有限公司）。

桃叶珊瑚苷（批号 T06-20131022）、绿原酸（批号 L11-20130502）、京尼平苷（批号 J04-20130113）、松脂醇二葡萄糖苷（批号 S21-20130811）对照品均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

杜仲样品采自10个不同产地（表 1），经南昌市食品药品检验所吴蓓主管药师鉴定为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv. 植物枝皮和板皮，干燥、粉碎，过三号筛备用。

表 1(Table 1)

表 1 样品信息 Table 1 Infermation of samples 编号 产地 编号 产地 1 陕西安康汉阴 6 江西吉安峡江 2 陕西汉中勉县 7 江西九江修水 3 湖南张家界慈利双云村 8 湖北襄阳 4 湖北恩施来凤 9 江西吉水八都 5 四川旺苍 10 江西井冈山

表 1 样品信息 Table 1 Infermation of samples

取本品0.3 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，称质量，超声处理30 min，用甲醇补足减失质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

分别取桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成各含0.321、0.052、0.072、0.084 mg/mL的混合对照品溶液。

Cosmosil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；波长208 nm；体积流量0.8 mL/min；柱温25 ℃；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，0～40 min，6%～16% A；40～75 min，16%～30%A，此色谱条件下桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷和其他相关峰均能达到基线分离，对照品与供试品分析图谱见图 1。

1-桃叶珊瑚苷 2-绿原酸 3-京尼平苷 4-松脂醇二葡萄糖苷 1-aucubin 2-chlorogenic acid 3-geniposide 4-pinoresinol diglucoside图 1 混合对照品 (A) 和供试品溶液 (B) 的HPLC图Fig. 1 HPLC of mixed reference substances (A) and test solution (B)

取0.321 mg/mL桃叶珊瑚苷、0.052 mg/mL的绿原酸、0.072 mg/mL京尼平苷以及0.084 mg/mL 的松脂醇二葡萄糖苷对照品，分别加甲醇稀释，作为不同系列对照品溶液，按上述色谱条件测定对照品峰面积，分别以对照品量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线并进行回归计算，得各对照品的标准曲线回归方程及线性范围（表 2），表明各化合物在相应范围内线性关系良好。

表 2(Table 2)

表 2 桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷线性关系 Table 2 Linear relationship of aucubin,chlorogenic acid,geniposide,and pinoresinol diglucoside 成分 线性方程 r 线性范围/μg 桃叶珊瑚苷 Y＝290.79 X－4.373 8 0.999 0.066 0～1.320 0 绿原酸 Y＝1 090.3 X－14.66 0.998 0.015 6～0.520 0 京尼平苷 Y＝664.4 X＋0.763 7 0.999 0.014 4～0.720 0 松脂醇二葡萄糖苷 Y＝2 410.6 X－105.62 0.998 0.042 0～1.260 0

表 2 桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷线性关系 Table 2 Linear relationship of aucubin,chlorogenic acid,geniposide,and pinoresinol diglucoside

取混合对照品，连续进样6次，按照“2.3”项下条件规定进行测定，计算桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷峰面积的RSD。结果表明，桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷峰面积的RSD分别为2.39%、1.42%、1.32%、2.05%，显示仪器精密度良好。

按“2.1”项下制备方法制备供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24 h后进样，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷峰面积的RSD。结果表明，桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷峰面积的RSD分别为1.29%、1.38%、1.26%、1.17%，表明供试品溶液中桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷在24 h内较稳定。

取同一批次样品（陕西汉中勉县）6份，按“2.1”项下方法，制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷的质量分数。结果桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷质量分数的RSD分别为1.10%、1.64%、1.90%、1.86%，表明本方法重复性良好。

精密称取已测定的杜仲（陕西汉中勉县）6份，分别置25 mL量瓶中，按80%、100%、120%的量各加入桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷对照品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷平均加样回收率分别为100.88%（RSD为1.03%）、99.98%（RSD为1.53%）、100.62%（RSD为1.75%）、100.75%（RSD为0.62%）。

取不同产地不同部位的杜仲样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件对桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷进行分析，根据线性方程计算质量分数，测定结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 杜仲4种成分的测定结果 Table 3 Determination of four constituents in E. ulmoides 编号 桃叶珊瑚苷/% 绿原酸/% 京尼平苷/% 松脂醇二葡萄糖苷/% 枝皮 板皮 枝皮 板皮 枝皮 板皮 枝皮 板皮 1 0.147 8 0.169 0 未检出 0.064 0.062 9 0.282 4 0.606 7 0.660 3 2 0.205 9 0.054 1 0.082 2 未检出 未检出 0.037 7 0.486 9 0.475 6 3 0.151 8 0.079 8 未检出 0.141 0 未检出 0.029 4 0.111 9 0.241 8 4 0.169 7 0.806 1 0.256 7 0.246 7 0.260 9 0.035 6 0.793 3 0.945 2 5 0.087 1 0.131 6 0.101 6 0.048 0 0.057 9 0.241 1 0.596 8 0.418 7 6 0.121 4 0.110 4 0.213 4 0.172 3 0.095 0 0.086 2 0.433 4 0.595 3 7 0.166 2 0.204 8 未检出 未检出 未检出 未检出 0.530 2 0.216 0 8 0.366 7 0.099 5 未检出 未检出 0.105 0 未检出 0.288 3 0.158 1 9 0.234 0 0.306 8 0.136 8 0.044 0 0.013 9 0.024 0 0.591 2 0.451 3 10 未检出 0.362 1 0.063 9 0.041 4 未检出 0.362 8 0.539 2 0.575 9

表 3 杜仲4种成分的测定结果 Table 3 Determination of four constituents in E. ulmoides

由表 3可见，江西九江修水（7号样品）和湖北襄阳（8号样品）的板皮和枝皮中均未测出绿原酸，陕西安康汉阴（1号样品）和湖南张家界慈利双云村（3号样品）的枝皮中未测出绿原酸，陕西汉中勉县（2号样品）的板皮中未测出绿原酸，药材供试品溶液的配制过程相同，可能和植物产地有关。另外其他产地中的板皮和枝皮中均测出有绿原酸，但枝皮中质量分数大于板皮。根据现有研究表明，绿原酸主要存在于植物的叶、花、茎和果实等鲜嫩部位；《中国药典》2010年版中以杜仲药材中松脂醇二葡萄糖苷为指标性成分，质量分数不得低于0.1%。由表 3可见，10个产地的杜仲药材中板皮和枝皮的松脂醇二葡萄糖苷质量分数均达到药典标准，板皮中的量大于枝皮，这与植物生长不同部位成分的积累差异有关；环烯醚萜类化合物广泛分布于植物的各个部位且结构不稳定，由表 3可见，桃叶珊瑚苷平均质量分数板皮稍大于枝皮，而京尼平苷的平均质量分数则为枝皮稍大于板皮。因此，在未来开发降压药物的时候可以提供更多药材部位的选择。

本实验在流动相选择过程中发现纯水分离对色谱峰有拖尾现象，加入酸性溶剂后得以改善，通过添加不同体积分数甲酸与磷酸后进行对比，发现加入0.1%磷酸的流动相系统中色谱峰分离效果较佳；在波长的选择中，根据4种对照品吸收波长差异，综合考虑后选择208 nm为同时检测这4种成分的最佳波长。

桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷为杜仲药材的主要有效成分，根据现有文献，大部分研究者主要考察杜仲药材的单一成分或者2个成分，同时考察主要是杜仲的叶，对板皮和枝皮研究较少，本实验采用RP-HPLC方法同时考察杜仲板皮和枝皮中4种主要有效成分，各成分峰形良好，分离度高，重复性好，为后续杜仲药材质量标准的建立提供参考价值。