连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl的干燥果实，含有丰富的挥发油，平均达3.8%^[1]，药理研究表明连翘油具有抑菌、抗炎、解热等药理作用^{[1, 2]}。薄荷油是薄荷的主要药效成分，是从唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq. 的新鲜茎叶中经蒸馏等方法得到的芳香油，具有清凉止痒、提神、解痉、祛风、抗炎镇痛等药理作用^{[3, 4]}。多种清热解毒药（如银翘合剂等）中均含有连翘油和薄荷油^[5]。由于挥发油具有易挥发、水溶性差和对胃肠道黏膜的刺激性，为了降低其挥发性、增大水溶性、提高稳定性，多将其制备成β-环状糊精（β-CD）包合物。有关连翘油和薄荷油的包合工艺，文献报道较多，但连翘薄荷混合挥发油的包合工艺研究未见报道。由于胶体磨包合挥发油具有包合温度低、时间短、包合率高、产量高、适合工业化生产等优点^[6]，为了提高包合物得率和包合率，本实验选用胶体磨法，以包合率和包合物得率为评价指标，采用单因素试验结合Box-Behnken响应面法，对影响包合的主要因素进行考察，以期得到包合率高且包合物得率高的最佳包合工艺。

AWS（SA）型电子称，上海英展机电企业有限公司；TQ直筒式多能提取罐，温州市森博轻工机械有限公司；EMS-9F型加热磁力搅拌器，天津市欧诺仪器仪表有限公司；J4W-L60型多功能胶体磨，温州昊星机械设备制造有限公司；CT-C-I型热风循环烘箱，江阴市苏新干燥设备有限公司；PTHW型调温电热套，上海耀裕仪器设备有限公司；YP-2型压片机，上海山岳科学仪器有限公司；傅里叶变换红外分光光度计，美国Thermo公司。

连翘，产于山西省，经江苏康缘药业股份有限公司吴舟主管药师鉴定为木犀科植物连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl的干燥果实；薄荷，产于江苏省，经江苏康缘药业股份有限公司吴舟主管药师鉴定为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq. 的干燥地上部分；连翘薄荷油，江苏康缘药业股份有限公司，批号110501；β-CD，曲阜天利药用辅料有限公司，批号F1205021；其余试剂均为分析纯。

根据连翘薄荷油提取工艺考察结果，取连翘90 kg，薄荷54 kg，投入多能提取罐中，加入10倍量纯化水，蒸汽加热，回流提取3 h，得连翘薄荷油2.475 L，连翘薄荷油得率为1.72%。连翘薄荷油置于4 ℃中贮存，备用。

按试验设计，取实验量纯化水和β-CD，于1 000 r/min下搅拌10 min使其混匀，继续搅拌同时缓慢滴加连翘薄荷油，搅拌5 min使其混匀后倒入胶体磨（功率11 kW，乳化细度2～50 μm）中进行挤压包合，一定时间后，放出包合物，40 ℃常压干燥16 h，粉碎，称定质量，得连翘薄荷油-β-CD包合物。按下式计算包合物得率。

包合物得率＝包合物质量/(β-CD投入量＋挥发油投入量)

取连翘薄荷油-β-CD包合物，用适量石油醚淋洗包合物表面未包合挥发油，于常压下干燥，称定质量，得淋洗后包合物。取100 g淋洗后包合物置于圆底烧瓶中，加适量纯化水，连接挥发油提取器，按《中国药典》2010年版一部附录XD挥发油测定法项下甲法读取挥发油提取量。另精密量取连翘薄荷油4 mL，同法操作读取连翘薄荷油回收量。按下式计算空白回收率和挥发油包合率。

空白回收率＝回收油体积/加入挥发油体积

包合率＝包合物实际收油量/(挥发油投入量×空白回收率)

按“2.2”项下包合物的制备方法，固定连翘薄荷油与β-CD的比例（mL∶g）为1∶8，包合时间为30 min，考察β-CD与水的比例（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶6，g∶mL）对挥发油包合率（Y₁）和包合物得率（Y₂）的影响。投料量和试验结果见表 1。随着β-CD与水的比例的减小，Y₁和Y₂均呈先增后减的趋势，但Y₂的变化不明显。当β-CD与水的比例为1∶3时，Y₁和Y₂均高于其他4个水平。因此，选择β-CD与水的比例在1∶2～1∶4进行Box- Behnken响应面优化，以确定最优的β-CD与水的比例。

表 1(Table 1)

表 1 β-CD与水的比例对包合工艺的影响 Table 1 Effects of β-CD-water ratio on inclusion process β-CD-水 挥发油/mL β-CD/g 水/L Y1/% Y2/% 1∶2 94 750 1.5 77.85 84.04 1∶3 63 500 1.5 80.49 85.20 1∶4 47 375 1.5 69.96 83.60 1∶5 38 300 1.5 62.31 82.58 1∶6 31 250 1.5 57.03 79.92

表 1 β-CD与水的比例对包合工艺的影响 Table 1 Effects of β-CD-water ratio on inclusion process

按“2.2”项下包合物的制备方法，固定β-CD与水的比例为1∶3（g∶mL），包合时间为30 min，考察连翘薄荷油与β-CD的投料比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8和1∶10，mL∶g）对Y₁和Y₂的影响。投料量和试验结果见表 2。连翘薄荷油与β-CD的投料比在1∶4～1∶8时，随着β-CD投料量的增加，Y₁和Y₂均增加，但Y₂增加幅度较小；连翘薄荷油与β-CD的投料比为1∶10时，Y₁和Y₂趋于平稳。因此，选择连翘薄荷油与β-CD的投料比为1∶6～1∶10进行Box-Behnken响应面优化，以确定最优的连翘薄荷油与β-CD的比例。

表 2(Table 2)

表 2 连翘薄荷油与β-CD的投料比对包合工艺的影响 Table 2 Effects of peppermint oil-β-CD feed ratio on inclusion process 挥发油-β-CD 挥发油/mL β-CD/g 水/L Y1/% Y2/% 1∶2 250 500 1.5 15.62 68.23 1∶4 125 500 1.5 35.58 75.45 1∶6 83 500 1.5 50.99 85.34 1∶8 62 500 1.5 82.76 89.72 1∶10 50 500 1.5 81.03 89.43

表 2 连翘薄荷油与β-CD的投料比对包合工艺的影响 Table 2 Effects of peppermint oil-β-CD feed ratio on inclusion process

按“2.2”项下包合物的制备方法，固定β-CD与水的比例为1∶3，连翘薄荷油与β-CD的比例为1∶8，考察包合时间（10、20、30、40、50 min）对Y₁和Y₂的影响。投料量和试验结果见表 3。随着包合时间的增加，Y₁和Y₂均呈现先增加后降低的趋势；包合时间为30 min时，二者均高于其他4个试验水平。因此，选择包合时间为20～40 min进行Box-Behnken响应面优化，以确定最优的包合时间。

表 3(Table 3)

表 3 包合时间对包合工艺的影响 Table 3 Effects of inclusion time on inclusion process 包合时间/min 挥发油/mL β-CD/g 水/L Y1/% Y2/% 10 62 500 1.5 45.32 68.34 20 62 500 1.5 73.62 88.79 30 62 500 1.5 81.21 90.74 40 62 500 1.5 65.76 88.56 50 62 500 1.5 61.54 80.42

表 3 包合时间对包合工艺的影响 Table 3 Effects of inclusion time on inclusion process

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken设计原理，设计17个试验点（5个零点）的响应面分析试验，分别以β-CD与水的比例（A）、连翘薄荷油与β-CD的投料比（B）、包合时间（C）为考察因素，Y₁和Y₂为响应值，优化连翘薄荷油-β-CD的包合工艺。Box-Behnken响应面的因素水平设计见表 4，各试验水平所用水量均为1.5 L，其他物质投料量按表 4的配比折算，结果见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 Box-Behnken响应面试验设计及结果 Table 4 Design and results of Box-Behnken test design 试验号 A B C/min Y1/% Y2/% 试验号 A B C/min Y1/% Y2/% 1 1∶3 (0) 1∶6 (-1) 40 (1) 45.72 71.23 10 1∶4 (1) 1∶10 (1) 30 (0) 76.31 90.11 2 1∶3 (0) 1∶8 (0) 30 (0) 84.82 92.18 11 1∶4 (1) 1∶6 (-1) 30 (0) 39.64 74.56 3 1∶3 (0) 1∶10 (1) 40 (1) 65.64 89.07 12 1∶2 (-1) 1∶10 (1) 30 (0) 76.53 83.41 4 1∶2 (-1) 1∶8 (0) 20 (-1) 78.79 91.06 13 1∶3 (0) 1∶8 (0) 30 (0) 82.13 94.09 5 1∶4 (1) 1∶8 (0) 20 (-1) 78.48 90.25 14 1∶3 (0) 1∶8 (0) 30 (0) 85.62 96.86 6 1∶3 (0) 1∶10 (1) 20 (-1) 80.83 92.57 15 1∶3 (0) 1∶8 (0) 30 (0) 82.56 96.42 7 1∶2 (-1) 1∶8 (0) 40 (1) 72.84 89.55 16 1∶2 (-1) 1∶6 (-1) 30 (0) 37.36 76.52 8 1∶3 (0) 1∶8 (0) 30 (0) 84.93 95.74 17 1∶3 (0) 1∶6 (-1) 20 (-1) 41.23 80.26 9 1∶4 (1) 1∶8 (0) 40 (1) 74.54 88.24

表 4 Box-Behnken响应面试验设计及结果 Table 4 Design and results of Box-Behnken test design

为了考察各影响因素及其交互作用对连翘薄荷油包合工艺的影响，利用Design-Expert 8.0.5b软件对表 4的试验结果进行二次多元回归拟合，Y₁对因素A、B、C的二次多项回归模型方程Y₁＝84.01＋0.43 A＋16.92 B－2.57 C－0.63 AB＋0.5 AC－0.492 BC－4.37 A²－22.18 B²－3.48 C²，R²＝0.991 0；Y₂对因素A、B、C的二次多项回归模型方程Y₂＝95.06＋0.33 A＋6.57 B－2.01 C＋2.16 AB－0.13 AC＋1.38 BC－3.71 A²－10.20 B²－1.58 C²，R²＝0.961 0；这2个模型的R²值分别为0.991 0、0.961 0，接近1，说明通过二次回归得到Y₁和Y₂模型与试验拟合较好。同时，响应面二次回归方程方差分析结果见表 5，结果显示Y₁和Y₂建立的回归整体模型均达到极显著性水平（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），因此Y₁和Y₂ 2个二次模型均成立。

表 5(Table 5)

表 5 响应面二次回归方程方差分析结果 Table 5 Variance analysis of response surface quadratic regression equation 差异来源 自由度 Y1 Y2 平方和 F值 P值 平方和 F值 P值 模型 9 4 748.95 85.58 ＜0.000 1 942.73 19.17 0.000 4 A 1 1.49 0.24 0.638 3 0.86 0.16 0.703 7 B 1 2 290.29 371.44 ＜0.000 1 345.71 63.27 ＜0.000 1 C 1 52.99 8.59 0.022 0 32.20 5.89 0.045 6 AB 1 1.56 0.25 0.630 1 18.75 3.43 0.106 4 AC 1 1.01 0.16 0.697 8 0.06 0.01 0.917 8 BC 1 96.83 15.70 0.005 4 7.65 1.40 0.275 5 A2 1 80.49 13.05 0.008 6 57.88 10.59 0.014 0 B2 1 2 071.33 335.92 ＜0.000 1 438.08 80.18 ＜0.000 1 C2 1 50.91 8.26 0.023 9 10.45 1.91 0.209 2 残差 7 43.16 38.25 失拟项 3 33.43 4.58 0.087 8 23.46 2.12 0.241 0 纯误差 4 9.73 14.79 总差 16 4 792.11 980.98

表 5 响应面二次回归方程方差分析结果 Table 5 Variance analysis of response surface quadratic regression equation

表 5的结果显示Y₁回归方程的方差分析表明，B、BC、A²、B²项达到极显著水平（P＜0.01），C、C²项达显著性水平（P＜0.05）。同时由F值大小可以推断，在所选择的试验范围内，3个因素对Y₁影响的排序为B＞C＞A。

利用Design-Expert 8.0.5b软件，根据拟合模型绘制不同影响因素对Y₁的三维曲线图（图 1），了解各因素的交互作用对Y₁的影响。图 1-a显示，Y₁随水与β-CD比例的增加先缓慢增加后缓慢减少，随β-CD投料量的增加先迅速增加后缓慢减少。图 1-b显示，Y₁随水与β-CD的比例的增加先缓慢增加后缓慢减少，随包合时间的增加先缓慢增加后缓慢减少。图 1-c显示，Y₁随β-CD投料量的增加先迅速增加后缓慢减少，随包合时间的增加先缓慢增加后缓慢减少。

图 1 因素A、B、C对Y1的响应面Fig.1 Effect of factors A,B,and C on response value of Y1

表 5的结果显示，Y₂回归方程的方差分析表明，B、B²项达极显著水平（P＜0.000 1），C、A²项达显著性水平（P＜0.05）。同时由F值大小可以推断，在所选择的试验范围内，3个因素对Y₂影响的排序为B＞C＞A。

利用Design-Expert 8.0.5b软件，根据拟合模型绘制不同影响因素对Y₂的三维曲线图（图 2），了解各因素的交互作用对Y₂的影响。图 2-a显示，Y₂随水与β-CD比例的增加先缓慢增加后缓慢减少，随β-CD投料量的增加先迅速增加后迅速减少。图 2-b显示，Y₂随水与β-CD的比例的增加先缓慢增加后缓慢减少，随包合时间的增加呈降低趋势。图 2-c显示，Y₂随β-CD投料量的增加先迅速增加后缓慢减少，随包合时间的增加呈降低趋势。

图 2 因素A、B、C对Y2的响应面Fig.2 Effect of factors A,B,and C on response value of Y2

理想的连翘薄荷油-β-CD包合工艺应在具有较高的Y₁的同时，还应具有较高的Y₂，同时还要考虑能耗等因素。对于多参数的优化过程应在相应的影响因素等高线图（图 1、2底部平面图）重合区域进行考察。在上述响应面模型分析的基础上，利用Design-Expert 8.0.5b软件对Y₁和Y₂ 2个二次回归方程求解，得最佳工艺条件为β-CD与水的比例为1∶3.10，连翘薄荷油与β-CD的比例为1∶8.74，包合时间为24.46 min，Y₁达88.6%，Y₂可达96.5%。

为检验预测的结果，需对预测的最佳工艺条件进行验证。为方便实际操作，将验证条件修正为β-CD与水的比例为1∶3，连翘薄荷油与β-CD的比例为1∶9，包合时间为25 min。按此工艺条件进行连翘薄荷油包合，平行操作3次，得到包合物得率依次为91.87%、95.23%、90.36%（均值为92.49%，RSD为2.7%），包合率依次为86.04%、88.07%和82.97%（均值为85.69%，RSD为3.0%），二者的实验值与与预测值比较，偏差为4.2%和3.2%。

偏差＝(实测值－预测值)/预测值^[7]

未用石油醚洗涤的包合物作为样品1；β-CD的水溶液作为样品2；连翘薄荷油的乙醇溶液作为样品3；用适量石油醚（60～90 ℃）洗涤包合物，干燥，取过量包合物，加水超声溶解20 min，取上清液作为样品4；包合物（洗涤）中提取挥发油的乙醇溶液作为样品5。分别取2 μL上述5种样品液，按从左到右的顺序点于同一硅胶G板上，以石油醚（60～90 ℃）-醋酸乙酯（17∶3）为展开剂，上行展开12 cm，取出，晾干，喷以5%香草醛-硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点清晰可见。结果如图 3所示，样品1有斑点，说明尚有挥发油未被包合；样品2和样品4无斑点，说明连翘薄荷油β-CD包合物制备完成；样品3和样品5在相同位置上有相同颜色的斑点，说明包合过程未改变连翘薄荷油的化学成分。

1-包合物（未洗涤） 2-β-CD的水溶液 3-连翘薄荷油 4-包合物（洗涤） 5-包合物（洗涤）中提取的挥发油 1-inclusion (not washing) 2-β-CD aqueous solution 3-forsythia peppermint oil 4-inclusion (washing) 5-volatile oil extracted from inclusion (washing) 图 3 薄层色谱图Fig.3 TLC

将β-CD、连翘薄荷挥发油和连翘薄荷挥发油- β-CD包合物（经石油醚洗涤）样品分别采用KBr压片法制备供试品。3个供试品分别进行IR扫描，其测定条件：扫描范围4 000～400 cm^-1，分辨率4 cm^-1，扫描次数30次。测定结果见图 4。由图 4可知，在3 000～2 800 cm^-1，β-CD有1个吸收峰，挥发油有3个吸收峰，包合物（经石油醚洗涤）有3个吸收峰，但分裂程度弱于挥发油；在1 800～1 600 cm^-1，β-CD和挥发油均出现1个吸收峰，而包合物（经石油醚洗涤）出现2个吸收峰，强度较弱，说明连翘薄荷挥发油-β-CD包合物制备完成。

图 4 IR扫描图Fig.4 IR scanning spectra

将β-CD、连翘薄荷油-β-CD包合物、连翘薄荷油与β-CD的混合物用水溶解后，取少量溶液滴到载玻片上，盖上盖玻片于显微镜下观察其影像结果。由图 5显微影像图观察得，β-CD的形状为半透明条状结晶；而连翘薄荷油和β-CD的混合物的影像图显示挥发油吸附于β-CD的表面，粘成一团；连翘薄荷油-β-CD包合物则为细小晶粒，呈不透明、相对分散的微细晶粒，没有明显的条块状结晶或油状物。在形成的包合物中，原来的β-CD半透明柱状晶体被挥发油充填，说明包合成功。三者的显微影像图显示β-CD与β-CD包合物的晶型明显不同，连翘薄荷油被β-CD包合成与物理混合物物相不同的包合物。

图 5 显微影像图 (10×10)Fig.5 Microscopic images (10 × 10)

响应面法^[8]是采用多元非线性拟合、二项式回归分析，囊括试验设计、建模、检验模型的合适性、寻求最佳组合条件等试验和统计技术，实验精确度优于正交设计和均匀设计。本实验在单因素试验的基础上，选用Box-Behnken响应面法，考察β-CD与水的比例、连翘薄荷油与β-CD的投料比和包合时间对连翘薄荷油包合率的影响，结果得到，连翘、薄荷混合挥发油胶体磨包合的最佳工艺为β-CD与水的比例为1∶3，连翘薄荷油与β-CD的比例为1∶9，包合时间为25 min。另外，本实验按响应面优化的工艺参数进行连翘薄荷油的包合，得包合物得率和包合率分别为92.49%和85.69%，与包合物得率的预测值（96.5%）和包合率的预测值（88.6%）的偏差较小，分别为4.2%和3.2%，证明响应面法拟合预测能力优异可靠，优化连翘薄荷油的包合工艺合理、可行。

包合物制备完成后需对其进行鉴别研究，目前包合物的鉴别方法有TLC法、IR法、显微影像、差热分析法、X射线衍射法等，本实验通过TLC法、IR法和显微影像初步验证了连翘薄荷油包合物已形成。

胶体磨法制备挥发油包合物一方面产品得率高、包合时间短，另一方面包合过程无需加热、占用空间小、设备投入少，适合企业工业化大量生产。此外，有文献报道^[9]，用一些有机溶剂（如乙醇）对挥发油稀释后再进行包合，可提高包合率，这些有机溶剂被称为分散剂。分散剂种类和量的不同对连翘薄荷油包合工艺有无影响以及影响程度如何有待进一步研究。