中草药  2015, Vol. 46 Issue (3): 384-388
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.03.015
严红梅, 贾晓斌, 张振海, 孙娥, 宋捷. 维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯对宝藿苷I抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响[J]. 中草药, 2015, 46(3): 384-388.
YAN Hong-mei, JIA Xiao-bin, ZHANG Zhen-hai, SUN E, SONG Jie. Effect of D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate on inhibition of MCF-7cell proliferation by baohuoside I[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2015, 46(3): 384-388.
维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯对宝藿苷I抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响
严红梅1,2, 贾晓斌1,2 , 张振海1 , 孙娥1, 宋捷1    
1. 江苏省中医药研究院 国家中医药管理局中药释药系统重点研究室, 江苏 南京 210028;
2. 南京中医药大学, 江苏 南京 210046
收稿日期: 2014-05-07;
基金项目： 国家自然科学基金资助项目(81274088,81303275);苏州2013年科技发展计划医疗器械与新医药专项(ZXY2013022)
作者简介：严红梅,博士研究生,研究方向为中药药剂新剂型.Tel:(025)85608672E-mail:yanhongmei0716@163.com
通讯作者：贾晓斌,博士生导师.Tel/Fax:(025)85637809E-mail:jiaxiaobinpharmacy@163.com张振海,助理研究员.Tel/Fax:(025)85637809E-mail:davidpharm@aliyun.com
摘要：目的 考察非离子表面活性剂维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)对宝藿苷I抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响.方法 MTT法测定宝藿苷I对MCF-7的细胞毒性,用荧光显微镜观察宝藿苷I的细胞摄取,并采用HPLC法测定细胞内的宝藿苷I的量.结果 在应用TPGS后,宝藿苷I对MCF-7增殖的抑制作用增强,在宝藿苷I低浓度的情况下作用更显著;当宝藿苷I与TPGS质量比分别为1:1、1:2、1:4时,在MCF-7细胞培养2 h的摄取率分别为29.51%、38.12%、40.37%,与仅用宝藿苷I相比分别提高了27.92%、65.24%、74.99%.结论 TPGS能够增加MCF-7对宝藿苷I的细胞摄取,并增强其对MCF-7的细胞毒作用.
关键词： 宝藿苷I     维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯     乳腺癌细胞MCF-7     细胞毒性     细胞摄取    
Effect of D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate on inhibition of MCF-7cell proliferation by baohuoside I
YAN Hong-mei1,2, JIA Xiao-bin1,2, ZHANG Zhen-hai1, SUN E1, SONG Jie1    
1. Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Materia Medica, Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China;
2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China
Abstract: Objective To investigate the effect of D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS) on the inhibition of proliferation of breast cancer cells MCF-7 by baohuoside I. Methods The cytotoxicity of baohuoside I to MCF-7 cells was determined by MTT assay, the cellular uptake of baohuoside I was detected by fluorescence microscopy, and the intracellular baohuoside I was determined by HPLC. Results The effect of baohuoside I on the inhibition of MCF-7 cell proliferation was enhanced in the presence of TPGS, especially on lower concentration. The uptake rates of MCF-7 within 2 h were 29.51%, 38.12%, and 40.37%, when the proportions of baohuosaide I and TPGS were 1:1, 1:2, and 1:4, respectively. The ratios were increased by 27.92%, 65.24%, and 74.99% compared with those using baohuoside I only. Conclusion TPGS can increase the uptake rate of baohuoside I in MCF-7 cells and enhance the inhibition of MCF-7 cell proliferation.
Key words: baohuoside I     D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate     breast cancer cell MCF-7     cytotoxicity     cell uptake    

宝藿苷I是淫羊藿中特有的黄酮类成分，具有明显的药理活性[1, 2, 3, 4, 5]。但是宝藿苷I的水溶性和膜渗透性较差，在Caco-2细胞转运实验中存在外排现象[6]。维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS）是维生素E的水溶性衍生物，具有两亲性和较大的分子表面积，是良好的非离子性表面活性剂，已载入《美国药典》[7]。也有文献报道，TPGS可用作某些药物的吸收促进剂、P-糖蛋白抑制剂等[8, 9]。

本课题组前期采用Caco-2模型研究TPGS对宝藿苷I吸收转运的影响，发现在应用TPGS后，宝藿苷I的外排比例得到下降，说明TPGS可以显著促进宝藿苷I的吸收[10]。研究表明，宝藿苷I对乳腺癌MCF-7细胞增殖有较好的抑制作用[11]，为进一步提高其药效，本实验通过考察宝藿苷I对MCF-7的细胞毒性作用和细胞摄取率，研究TPGS对宝藿苷I抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。

1 材料 1.1 药品与试剂

宝藿苷I对照品（自制，质量分数＞98%）；TPGS（Aladdin，批号L1303022）；顺铂（南京制药厂有限公司，批号20140411）；RPMI 1640培养基（南京凯基生物科技发展有限公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；胎牛血清（Gibco）；甲醇为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；数显气浴恒温振荡器（金坛市双捷实验仪器厂）；BP-211D分析电子天平（德国Sartorius公司）；CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 细胞

人乳腺癌细胞MCF-7（南京凯基生物科技发展有限公司）。

2 方法 2.1 HPLC法测定宝藿苷I方法学考察 2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取宝藿苷I对照品6.27 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得627.0 μg/mL对照品储备液。精密移取宝藿苷I储备液分别加甲醇稀释成质量浓度为62.70、25.08、12.54、6.27、2.51 μg/mL对照品溶液，备用。

2.1.2 色谱条件[1]

色谱柱Hedera C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（75∶25）；检测波长270 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL。

2.1.3 线性关系考察

取“2.1.1”项中配制的系列对照品溶液，按上述色谱条件测定，以对照品溶液的进样质量浓度（C）为横坐标，峰面积积分值（A）为纵坐标，得到标准曲线：A＝38.358 C－6.301 7，r＝0.999 8，结果显示，宝藿苷I在2.51～62.70 μg/mL线性关系良好。

2.1.4 稳定性试验

分别配制宝藿苷I浓度为20 μmol/L，TPGS浓度分别为0、20、40、80 μmol/L的溶液，置37 ℃恒温水浴中，分别于0、2、4、8、12 h进样，测定宝藿苷I峰面积，考察宝藿苷I溶液的稳定性。结果在37 ℃条件下各组宝藿苷I溶液在12 h内保持稳定，没有发生降解或沉淀。

2.1.5 重复性试验

平行制备5份供试品溶液，进行测定，结果宝藿苷I质量浓度的平均值为26.17 μg/mL，RSD为0.94%，表明此测定方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验

按照《中国药典》2010年版二部附录XIXA项下方法，分别设计高、中、低3个质量浓度，每个质量浓度各制备3份供试品溶液，进行加样回收率试验。结果平均加样回收率为99.63%，RSD为1.31%，表明此测定方法回收率良好。

2.2 宝藿苷I的溶解度测定

按照文献报道的方法[12]，测定宝藿苷I及其与TPGS的混合物在水中的溶解度。分别称取过量的宝藿苷I、宝藿苷I和TPGS（浓度比分别为1∶1、1∶2、1∶4）的物理混合物于5 mL双蒸水中，超声至药物不再溶解，放入恒温振荡器中，温度保持（25±2）℃，振摇24 h，3 000 r/min离心15 min，吸取适量饱和上清液，乙醇稀释至线性范围，用0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1.2”项色谱条件进行HPLC测定。

2.3 细胞毒性实验[13]

取状态良好并处于对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7，胰酶消化后，用含10% FBS的RPMI 1640培养基稀释至细胞密度为1×105个/mL，吹打均匀后取100 μL细胞悬液于96孔板，置37 ℃培养箱孵育24 h使其贴壁。将宝藿苷I、宝藿苷I-TPGS（1∶2）用少量二甲基亚砜（DMSO）溶解，并以无血清的RPMI 1640培养基分别稀释成系列浓度（DMSO体积分数低于0.1%），顺铂注射液以无血清的RPMI 1640培养基稀释成系列浓度，将所配制的各试药分别加入96孔板中，每孔加100 μL，每个浓度6个平行孔，以正常培养基为对照，将培养板继续置于培养箱中孵育24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，置培养箱中孵育4 h。甩板，吸干孔内残留液体，每孔加入100 μL DMSO，于振荡器上振荡10 min以溶解蓝紫色结晶物。在570 nm波长下，用酶标仪测定吸光度（A）值，计算细胞存活率[14]。

细胞存活率＝A样品/A对照

考察宝藿苷I与不同比例TPGS的混合物对MCF-7细胞抑制作用时，TPGS单用的浓度设为80 µmol/L，宝藿苷I的浓度设为20 µmol/L，宝藿苷I与TPGS比例设为1∶1、1∶2、1∶4；考察TPGS对不同浓度宝藿苷I对MCF-7细胞增殖抑制的促进作用时，宝藿苷I的浓度设为10、20、40 µmol/L，宝藿苷I与TPGS的比例固定为1∶2，其他操作同上。

2.4 细胞摄取实验

将MCF-7细胞接种于6孔培养板中，细胞培养箱中培养24 h，使其贴壁移去原有培养基，分别加入经无血清培养基稀释的宝藿苷I（20 μmol/L）或宝藿苷I-TPGS（1∶1）、宝藿苷I-TPGS（1∶2）、宝藿苷I-TPGS（1∶4）混合物，孵育2 h，孵育结束后，快速弃去培养基，加入冷的PBS终止细胞摄取，并冲洗细胞3遍。加入1 mL蒸馏水，刮取细胞，将细胞悬液收集并置于冰浴下超声破碎细胞，离心，吸取上清液于另一干净离心管中，用氮气吹干，甲醇溶解，用0.45 μm微孔滤膜滤过，定容至1 mL，供HPLC测定宝藿苷I[15]。

考察摄取率与宝藿苷I浓度的关系时，宝藿苷I的浓度分别设为10、20、40 μmol/L，宝藿苷I与TPGS的浓度比固定为1∶2；考察摄取率与摄取时间的关系时，宝藿苷I的浓度设为20 μmol/L，宝藿苷I与TPGS的浓度比固定为1∶2，分别孵育1、2、4 h，其他操作同上。

2.5 统计学方法

结果均以x ± s表示，采用SPSS 16.0软件处理数据，组间比较行单因素方差分析。

3 结果 3.1 宝藿苷I的溶解度

结果显示，宝藿苷I、宝藿苷I-TPGS（1∶1）、宝藿苷I-TPGS（1∶2）、宝藿苷I-TPGS（1∶4）在水中的表观溶解度分别为（12.72±0.32）、（69.41±0.95）、（113.43±2.18）、（152.21±3.46）μg/mL，提示TPGS的加入能提高宝藿苷I在水中的溶解度，并且随着TPGS比例的增加，宝藿苷I在水中的溶解度也逐渐增大，说明TPGS能显著提高宝藿苷I的水溶性，改善其理化性质。原因可能是TPGS本身是一种非离子性表面活性剂，当TPGS达到一定浓度时，会通过胶束增溶作用，改善难溶性药物的溶解性能。

3.2 细胞毒性比较

宝藿苷I、宝藿苷I-TPGS（1∶2）以及阳性药顺铂孵育MCF-7细胞24 h后的半数生长抑制浓度（IC50）值分别为（18.51±0.31）、（12.18±0.22）、（4.3±0.27）μmol/L，发现与宝藿苷I相比，加入TPGS的药物组的IC50值降低，差异具有显著性。MCF-7细胞用宝藿苷I（20 μmol/L）、TPGS（80 μmol/L）和宝藿苷I-TPGS（1∶1）、宝藿苷I-TPGS（1∶2）、宝藿苷I-TPGS（1∶4）孵育24 h的细胞抑制率见图 1。空白辅料TPGS在MCF-7细胞中孵育24 h，80 μmol/L时细胞抑制率在5%以下，说明TPGS是安全无毒的药用辅料。宝藿苷I与不同比例TPGS的混合物对MCF-7细胞增殖的抑制作用均高于宝藿苷I原料药组，且差异具有显著性（P＜0.05、0.001）。

与宝藿苷I组比较：*P＜0.05 ***P＜0.001，下同*P < 0.05 ***P < 0.001 vs baohuoside I group,same as below图 1 TPGS、宝藿苷I、宝藿苷I与不同比例TPGS的混合物对MCF-7细胞的增殖抑制作用(x±s , n=6)Fig. 1 Inhibition of TPGS,baohuoside I,and mixtures of baohuoside I and TPGS in different ratios on proliferation of MCF-7 cells(x±s , n=6)

图 2反映了TPGS（宝藿苷I与TPGS的浓度比固定为1∶2）对不同浓度宝藿苷I（10、20、40 μmol/L）抑制MCF-7细胞增殖的促进作用，结果显示，TPGS促进低浓度的宝藿苷I抑制细胞增殖的作用更强，即当宝藿苷I浓度分别为10、20、40 μmol/L时，TPGS使其对MCF-7细胞增殖抑制率分别提高55.08%、43.92%、11.95%。

图 2 TPGS对不同浓度宝藿苷I抑制MCF-7细胞增殖的促进作用(x±s , n=6)Fig. 2 Promotion of TPGS on inhibition of baohuoside I at different concentration on proliferation of MCF-7 cells(x±s , n=6)
3.3 细胞摄取研究

细胞摄取实验结果见表 1～3，相比宝藿苷I原料药，宝藿苷I与不同比例TPGS的混合物作用后MCF-7细胞对宝藿苷I的摄取率均有所提高，且随着TPGS比例的增加，宝藿苷I也更容易被MCF-7细胞摄取，并且宝藿苷I、宝藿苷I-TPGS（1∶2）作用后细胞对宝藿苷I的摄取率在1～4 h内有一定的浓度和时间相关性。

表 1 宝藿苷I、宝藿苷I与不同比例TPGS的混合物作用MCF-7细胞2 h后细胞对宝藿苷I的摄取率(x±s , n=3) Table 1 Uptake ratesof baohuoside I in MCF-7 cells treated with baohuoside I and mixtures of baohuoside I and TPGS in different ratios for 2 h(x±s , n=3)

表 2 不同浓度宝藿苷I、宝藿苷I-TPGS (1∶2) 作用MCF-7 细胞2 h后细胞对宝藿苷I的摄取率(x±s , n=3) Table 2 Uptake ratesof baohuoside I in MCF-7 cells treated with baohuoside I at different concentration and mixtures of baohuoside I and TPGS (1∶2)for 2 h(x±s , n=3)

表 3 宝藿苷I (20 μmol/L)、宝藿苷I-TPGS (1∶2) 作用MCF-7 细胞不同时间后细胞对宝藿苷I的摄取率(x±s , n=3) Table 3 Uptake rates of baohuoside I in MCF-7 cells treated with baohuoside I (20 μmol/L) and mixtures of baohuoside I and TPGS (1∶2) for different times(x±s , n=3)
4 讨论

TPGS在制剂中可作为增溶剂[16]、吸收促进剂[17]以及固体分散体的载体等，还可以抑制P-糖蛋白的外排作用，提高受P-糖蛋白阻滞的药物的生物利用度，对于难溶性药物是一种良好的非离子性表面活性剂。与其他表面活性剂相比，TPGS具有的生育酚酯结构，具有一定的抗氧化性，有助于增加制剂的稳定性[18]。

本研究通过细胞毒性实验和细胞摄取实验考察了TPGS对宝藿苷I抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响，MTT实验结果表明在应用TPGS后，宝藿苷I对MCF-7增殖的抑制作用增强，对这一现象的研究显示，TPGS能通过胶束增溶作用改善宝藿苷I的溶解性能；另外，已有的研究表明，宝藿苷I在Caco-2细胞转运实验中存在明显的外排现象[5]，而低浓度的TPGS可以通过抑制ATP-酶而抑制ATP-酶介导的P-糖蛋白外排[19]，因此能提高宝藿苷I被MCF-7细胞的摄取率。相比宝藿苷I原料药，宝藿苷I与不同比例TPGS的混合物的细胞摄取率均有所提高，这一实验结果进一步证实了TPGS能促进宝藿苷I的抗乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用。

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