2015, Vol. 46
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.03.011 |
2. 中国药科大学 药物质量与安全预警教育部重点实验室, 江苏 南京 210009
2. Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance, Ministry of Education, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China
甘草酸二铵是甘草有效成分的第3代提取物，具有一定的抗炎、保护肝细胞膜及改善肝功能的作用，此外，还作为甜味剂和表面活性剂广泛应用于食品和日用化学工业，其中18β-甘草酸（18α- glycyrrhizic acid）是该品的主要成分[1, 2]。目前甘草酸二铵制剂中有关杂质的研究仅停留在有关物质总量检测或几个杂质鉴定阶段[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]，未见其有关物质结构种类的系统鉴定研究报道。本实验利用超高效液相-二极管阵列-离子阱-飞行时间串联质谱（ultra high performance liquid-diode array-ion trap-the time of flight tandem mass spectrometry，UPLC- DAD-IT- TOF-MS）对甘草二铵肠溶片（Diammonium Glycyrrhizinate Enteric Coated Tablet，DGECT）中有关物质进行了分离及鉴定，明确了8种杂质的种类及其相对含量。研究结果为甘草酸二铵产品的质量控制和质量标准完善提供了方向和依据。
1 仪器与材料UPLC-DAD-IT-TOF-MS，日本Shimadzu公司，配有电喷雾电离源（ESI）和LC-MS Solution Version 3.60.361色谱工作站。
甘草酸二铵肠溶片，规格50 mg/片，批号20130701、20130702、20130703，福建省力菲克药业有限公司生产；标准对照品为甘草酸单铵盐（单铵盐在溶液中即解离为18β-甘草酸）：欧洲药典标准品；产品代码G046000；产品系列号003x89，乙腈为色谱纯，默克公司；冰醋酸为分析纯，南京化学试剂厂；纯水为Milli-Q新鲜制备。
2 方法 2.1 分析方法 2.1.1 色谱条件色谱柱为Agilent HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水-冰醋酸（380∶614∶6）；体积流量1 mL/min，柱后分流比为1∶3；DAD检测波长254 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。
2.1.2 质谱条件氮气体积流量1.5 L/min，干燥气：100.0 kPa，离子累计时间：10 ms；离子管路模块温度：200 ℃，检测器电压1.6 kV，正/负离子切换监测，正离子模式电喷雾电压＋4.5 kV，负离子模式电喷雾电压-3.5 kV。
2.2 样品处理方法取各批次甘草酸二铵肠溶片各1片，研细，取相当于1片的量，全部转移至10 mL量瓶中，加流动相适量，超声30 min溶解，加流动相稀释至刻度，取1 mL该溶液至1.5 mL的塑料离心管中，14 000 r/min离心8 min，上清液0.22 μm滤膜滤过，取500 μL滤液加入200 μL双蒸水，摇匀，取10 μL进样分析。
3 结果在确定的实验条件下，甘草酸二铵肠溶片供试品溶液的UPLC-DAD色谱图和IT-TOF质谱见图 1，鉴定结果见表 1。
 | 图 1 甘草酸二铵肠溶片的典型的UPLC-UV谱图 (A) 和典型UPLC-IT-TOF-MS总离子流图 (B)Fig. 1 Typical UPLC-UV (A) and UPLC-IT-TOF-MS total ions patern (B) of DGECT |
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表 1 甘草酸二铵肠溶片相关物质质谱信息 Table 1 Mass spectral data of related substances in DGECT |
从表 1可见，峰4、5、7、8、9的准分子离子峰 [M－H]- 为821.38，[M＋H]+ 为823.40，确定这5种物质的相对分子质量为822.40。
利用工作站的同位素匹配功能对各离子峰的同位素峰进行匹配，结果见图 2（以18β-甘草酸为例），进一步参考MS1～MS3质谱峰的精确质量信息，推测该5种物质为分子式C42H62O16的同分异构体。参考文献推测它们为18β-甘草酸、18α-甘草酸、甘草酸皂苷E2、甘草酸皂苷H2和乌拉尔甘草皂苷A或B。由对照品峰可知峰4为18β-甘草酸。
 | 图 2 18β-甘草酸的 [M＋H]+ (A) 和[M－H]- (B) 同位素匹配结果及裂解示意图Fig. 2 [M + H]+ (A) and [M－H]-(B) isotope matching results of 18β-glycyrrhizinate and clearage schematic diagram |
峰2的准分子离子峰[M－H]-为837.38，[M＋H]+为839.40，确定其相对分子质量为838.40，比18β-甘草酸多了16，可能多了1个氧，同时根据同位素匹配、MS1～MS3质谱峰的精确质量信息，推测该物质为分子式C42H62O17的甘草酸皂苷G2，结果见图 3。
 | 图 3 甘草酸皂苷G2的 [M＋H]+ (A) 和[M－H]- (B) 同位素匹配结果及裂解示意图Fig. 3 [M + H]+ (A) and [M－H]- (B) isotope matching results of licorice saponin G2 and clearage schematic diagram |
同理推测峰6为甘草酸皂苷B2，峰10为甘草酸皂苷J2，峰11为甘草酸皂苷C2。
4 讨论甘草酸二铵是肝病的常用药之一，主要用于伴有谷丙转氨酶（又名丙氨酸转氨酶）升高的慢性迁延性肝炎及慢性活动性肝炎。本品具有较强的抗炎、保护肝细胞膜及改善肝功能的作用。然而，对甘草酸二铵制剂质量控制上却存在诸多不确定因素。本研究成功地建立了UPLC-DAD-IT-TOF-MS联用分析甘草酸二铵肠溶片产品中的甘草皂苷类化合物的方法，根据获得的各化合物的母离子和二级离子的精确相对分子质量及同位素信息，参照部分对照品和相关文献，对甘草酸二铵肠溶片中的9种化合物进行了快速准确鉴定，为甘草酸二铵产品的质量控制及潜在药效物质基础的探寻提供了一种快速高效的方法。但多级质谱技术在结构鉴定方面依然存在一定的局限性，18α-甘草酸、甘草酸皂苷H2、乌拉尔甘草皂苷A与乌拉尔甘草皂苷B，结构的差别仅在于糖苷键的连接方式不同，仅通过质谱数据信息不能对取代基以及糖基结合位点进行精确确认。
本实验建立了UPLC-DAD-IT-TOF-MS定性分析甘草酸二铵肠溶片中有关物质的研究方法，发现了9种有关物质，并鉴定了其中的8种甘草皂苷。研究结果为甘草酸二铵的质量控制及质量标准完善提供了参考依据。
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